高通量研究脊椎動物多維表型的新方法
Nature Communications 4, February 12, 2013, Article number:1467, doi:10.1038/ncomms2475
Carlos Pardo-Martin, Amin Allalou, Jaime Medina, Peter M. Eimon, Carolina Wählby Mehmet Fatih Yanik
1 Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology (MIT)
1 Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology (MIT)
2 Division of Health Sciences and Technology, MIT,
3 School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University
4 Centre for Image Analysis, Science for Life Laboratory, Uppsala University, Sweden.
5 Imaging Platform, Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard
6 Department of Biological Engineering, MIT
關鍵詞：
大顆粒流式分選系統(tǒng)，脊椎動物，斑馬魚(zebrafish、Danio rerio)，體內多維表型研究，致畸劑，高通量光學投影層析成像系統(tǒng)，高通量篩選（HTS），高內涵篩選（HCS），OPT系統(tǒng)，三維重構
摘要：
動物個體內，多數由基因突變與生物活性分子所引發(fā)的復雜生理應答機制，無法使用細胞培養(yǎng)模型進行預測，而動物水平研究卻進展緩慢。本研究中，我們利用微米分辨率的高通量光學投影層析成像系統(tǒng)，結合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實現了脊椎動物的整體多維度掃描。系統(tǒng)以前所未有的速度與細節(jié)，在三個維度水平，自動獲取了半透明斑馬魚幼體數以百計的獨特形態(tài)特征與復雜表型。通過聚集、量化多種表型特征，我們能夠實現同時檢測、分類多個生物學進程中的精細變化。我們將這種方法稱為體內多維表型研究。為了驗證體內多維表型研究方法的巨大作用，我們利用200個獨立形態(tài)檢測參數，對數十種致畸劑（可引起軟骨形成異常）效應進行分析，結合致畸劑的已知機制，識別其相似和不同之處。
背景：
針對多種因素引起的形態(tài)學變化特征，進行高通量篩選，是現代生物學研究與藥物篩選中必不可少的。當前研究中，在細胞學水平高通量篩選（HTS）獲得的有效藥物，在進一步動物水平研究和臨床研究時，結果不盡如人意。即使是最復雜的體外模型，也無法完全展現器官形成的復雜程度與構成等信息。為了克服體外模型在藥物篩選等應用中的不足，越來越多的化學藥物使用斑馬魚(zebrafish、Danio rerio)個體進行篩選研究。斑馬魚幼體是目前廣泛應用于藥物篩選的脊椎動物模型。針對斑馬魚的大規(guī)�；蛩胶Y選工作已經開展了數十年，但由于所讀取的結果往往無法定量說明或局限在有限的參數記錄，因此需要更完善的解決方案。
為了將數百種表型的改變進行定量記錄分析，并實現高內涵篩選（HCS），我們應用高通量光學投影層析成像系統(tǒng)（high-throughput optical projection tomography system，OPT），該系統(tǒng)結合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），配合特殊的圖像處理算法，能夠兼容各種顯微鏡，從而獲得微米級分辨率的3D器官或復雜形態(tài)學特征參數。這一技術幫助我們從大量動物樣本中快速獲得數百種獨特形態(tài)特征和復雜表型的信息。
結果與分析：
1.Union Biometrica BioSorter® Flow Cytometry（新式高通量分選OPT系統(tǒng)）：射流系統(tǒng)與顯微觀察系統(tǒng)組。BioSorte®不需要對斑馬魚樣本進行預處理，避免了常規(guī)OPT技術中最耗費時間的步驟。
2.圖像矯正過程：通過多步圖像軟件矯正，獲得準確的層析重建圖像。
3.顱面畸形三維重建與評估：每條斑馬魚幼體，記錄高達320幀的圖像，通過三維重構技術，形象化展示了斑馬魚幼體軟骨復雜表型。圖像顯示的層析效果圖充分顯示了三種不同藥物處理后的5dpf斑馬魚幼體的顱面骨骼變化。三種藥物是：retinoic acid（視黃酸）、cyclopamine（環(huán)巴胺）和flusilazole（氟硅唑）。
4.藥物篩選研究實例：不同濃度環(huán)巴胺藥物對三種軟骨生長的影響
5.體內多維度表型分析：為了全面定量斑馬魚幼體表型變異情況，研究者計算了202個獨立的指標，用于重建3D表型圖。這些參數包含了長度、3D方向、表面積及各種骨骼體積等等。
6.大量斑馬魚幼體表型變化陣列分布：每一行代表了一種藥物作用斑馬魚幼體的影響。檢測結果以顏色表示，紅色代表幼體個體表型相對未處理幼體表達下降，綠色代表表達增長。
結論：
傳統(tǒng)藥物高內涵篩選（HCS）技術局限在簡化的生物模型，如無線增殖的細胞系等，而在使用原代細胞、in vivo動物模型等進行HCS研究時，傳統(tǒng)技術面臨眾多的問題。本研究利用微米分辨率的高通量光學投影層析成像系統(tǒng)，結合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實現了脊椎動物的整體多維度掃描。本技術能夠提供脊椎動物器官和組織的3D重建圖像，針對斑馬魚幼體的研究，本技術通過能夠為研究者提供樣本個體的多種表型特征，為動物個體水平實現藥物高內涵篩選（HCS）提供了可行的技術平臺。
相關介紹：
Union Biometrica大顆粒流式分選系統(tǒng)：是基于流式細胞技術開發(fā)的，與普通的流式細胞技術相比有非常很重要的特點和優(yōu)勢：
這是市面上唯一的能夠分選1-1500um生物微粒的全自動高通量分選系統(tǒng)。他的管路直徑大，可以用來分選體積較大的生物微粒，因此可以用來應用于小的模式生物，比如斑馬魚，線蟲、果蠅等，也可應用于大體積細胞：胚胎干細胞，胰島細胞、肝細胞，細胞簇等，還可用于藥物化合物的高通量的藥物篩選。這款儀器的技術核心，是氣流分選裝置，通過氣流就行微粒的分選，這種方式非常溫和，確保了收集到的生物活體或敏感物質的活性和完整性。
Union Biometrica流式分選系統(tǒng)進行斑馬魚研究的文獻：
1.Presenting VAST BioImager™: A new modular, expandable platform to automate the orientation of 2-7 day old zebrafish larvae for imaging
2.Development and Validation of an Automated High-Throughput System for Zebrafish In Vivo Screenings
3.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing
4.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing
5.A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression
6.Zebrafish high throughput screening using robotic injection technology
7.High-throughput in vivo vertebrate screening.
8.Zebrafish High-Throughput Screening of Innate Immune Responses.
9.A High-Throughput Assay To Measure Whole Body Metabolic Rate Using Zebrafish Larvae.
10.A Whole-Animal Microplate Assay for Metabolic Rate Using Zebrafish
