利用ImageXpress Micro進(jìn)行長時間活細(xì)胞成像和心肌細(xì)胞功能評價
利用進(jìn)行長時間活細(xì)胞成像和心肌細(xì)胞功能評價
活細(xì)胞成像技術(shù)是最近幾年興起的一項技術(shù)，能夠在細(xì)胞接近生理的狀態(tài)下觀察細(xì)胞形態(tài)改變和蛋白的表達(dá)，該技術(shù)能夠避免傳統(tǒng)采用固定細(xì)胞或組織的研究方法中，固定細(xì)胞過程中造成的細(xì)胞形態(tài)的改變和結(jié)構(gòu)改變，能夠更加真實的反映出細(xì)胞的特性，因而廣受推崇。MD 高內(nèi)涵系統(tǒng)具有多種特性能夠進(jìn)行長達(dá)數(shù)天的活細(xì)胞的觀察，同時，由于采用著名的MD軟件產(chǎn)品MetaMorph為基礎(chǔ)的MetaXpress高內(nèi)涵分析軟件，具有極高的靈活性和擴(kuò)展能力，除活細(xì)胞成像之外還能夠能夠?qū)δ承┘?xì)胞（如心肌細(xì)胞）的生理藥理特性進(jìn)行評價。
神經(jīng)細(xì)胞長時間成像
神經(jīng)細(xì)胞是公認(rèn)的較為敏感和脆弱的細(xì)胞，對于外界環(huán)境較為敏感。對于活的神經(jīng)細(xì)胞的長時間培養(yǎng)和觀察具有較大困難。采用能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的長時間觀察培養(yǎng)。
方法：
從新生大鼠大腦海馬獲得約1立方毫米大小組織塊。移入含有0.25%胰酶的離心管中37℃，5%CO2 孵育箱內(nèi)消化20～30 min。加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，離心重懸細(xì)胞，按0.6×105/ml 鋪于96 孔板中。24 h 后換為NeurolbasalMedium/B27 無血清培養(yǎng)液，以后每2~3 d 半量換液1 次。7 d 后獲得原代神經(jīng)細(xì)胞。
圖像獲�。�
將樣品放入有環(huán)境控制功能的MD 內(nèi)，采用激光自動聚焦進(jìn)行樣品聚焦，在10X物鏡下每隔5分鐘進(jìn)行一次相差圖像拍攝，結(jié)果如下：
小結(jié)：
采用的環(huán)境控制系統(tǒng)能夠維持細(xì)胞所需的溫度、濕度和CO2條件，其中溫度為細(xì)胞的酶活性提供了溫度保障，確保細(xì)胞的生理機(jī)能，濕度維持能夠保證細(xì)胞外液不會蒸發(fā)，避免了胞外滲透壓的升高造成的細(xì)胞脫水，CO2能夠維持細(xì)胞外液的pH值。
除了維持細(xì)胞的生存環(huán)境外，在進(jìn)行敏感、脆弱細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）的長時間觀察過程中，最為重要的是減小對細(xì)胞的刺激，盡可能的保持細(xì)胞的活性。采用激光自動聚焦技術(shù)，在聚焦的過程中，細(xì)胞無需受到光照，這樣就避免了細(xì)胞內(nèi)的光化學(xué)反應(yīng)和光照升溫，能夠很好的維持細(xì)胞的活性狀態(tài)。因此，在長時間活細(xì)胞的觀察過程中，以上兩點不可或缺。
心肌干細(xì)胞細(xì)胞的功能評價
采用的軟件系統(tǒng)功能強(qiáng)大，具有無限的擴(kuò)展功能。因此，除了能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞的長時間觀察和細(xì)胞的形態(tài)、蛋白表達(dá)等分析，還能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞功能學(xué)的評價。
干細(xì)胞研究是目前生物學(xué)研究的熱點，采用人類的干細(xì)胞（如心肌干細(xì)胞）能夠加快研究的速度，同時還能夠真實反映人體細(xì)胞的功能，還能加快藥物進(jìn)入臨床的速度。iPS來源的心肌細(xì)胞因其表達(dá)的離子通道、自發(fā)節(jié)律特性、與原代心肌細(xì)胞特性相似的特性尤其引人注目，通過該細(xì)胞可以進(jìn)行心肌細(xì)胞特性的研究，并能縮短藥物篩選的時間與臨床前實驗的周期。
方法：
采用Cellular Dynamics公司的iPS來源的心肌細(xì)胞，將其鋪于96孔板，并在培養(yǎng)液中孵育2-7天，以Calcein AM孵育10分鐘，將培養(yǎng)液棄去后，加入不同濃度的激動劑和抑制劑。
圖像獲取和結(jié)果：
心肌細(xì)胞的成熟狀況要通過細(xì)胞自發(fā)的節(jié)律性收縮來進(jìn)行判定。細(xì)胞的節(jié)律性收縮可以通過電生理的方法進(jìn)行檢測。但是電生理的方法相對較復(fù)雜，因此我們采用熒光圖像的自動分析來取代。
首先采用延時拍攝或?qū)崟r拍攝的方法我們可以獲得細(xì)胞節(jié)律性收縮的一組圖像，
MetaXpress對心肌細(xì)胞跳動進(jìn)行自動分析
圖3. 將獲得的心肌細(xì)胞跳動的一組圖像生成圖像堆棧，采用Journal擴(kuò)展獲得的功能模塊自動分析相鄰兩個時間點圖像的差別，一次來判定心肌細(xì)胞的跳動頻率和幅度，采用功能模塊中的計數(shù)器自動計算心肌跳動的頻率和幅度。在Journal擴(kuò)展的功能模塊中以上功能自動完成，并直接報告心肌細(xì)胞跳動頻率和幅度信息
心肌跳動模式檢測
我們采用經(jīng)典陽性藥物異丙腎上腺素、腎上腺素、咖啡因作為刺激劑，用已知的心肌細(xì)胞抑制劑乙酰膽堿來進(jìn)行心肌跳動模式的檢測和心肌跳動分析模塊的功能。
四種藥物不同濃度作用下心肌細(xì)胞跳動頻率的變化。細(xì)胞自發(fā)跳動節(jié)律各有不同，通常為20-40次/分鐘。給藥后的5-60分鐘內(nèi)，心肌跳動頻率穩(wěn)定，因此以上均為給藥后10分鐘檢測結(jié)果。
小結(jié)：
采用的高度靈活的系統(tǒng)能夠?qū)π募〖?xì)胞進(jìn)行自動成像，其采用的MetaXpress軟件具有極高的靈活性，其具有的Journal功能能夠根據(jù)圖像和實驗要求進(jìn)行隨意的擴(kuò)展，除了進(jìn)行心肌細(xì)胞生理學(xué)評價之外，還能進(jìn)行超過1000個功能的擴(kuò)展。
標(biāo)簽：
ImageXpress Micro 心肌細(xì)胞 活細(xì)胞成像
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