xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)評(píng)測(cè)內(nèi)源性G-偶聯(lián)蛋白受體（GPCRs）功能

Jeff Irelan 美國(guó)圣地亞哥ACEA Biosciences 公司
Jonathan H. Morgan 美國(guó)弗吉尼亞州Manassas ATCC 產(chǎn)品經(jīng)理

前言

    G-偶聯(lián)蛋白受體（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是當(dāng)今臨床與科研藥物的單一治療靶點(diǎn)，也是迄今發(fā)現(xiàn)最大的靶點(diǎn)家族。據(jù)推測(cè)人基因組中，該家族的功能成員超過300個(gè)，涉及多種不同細(xì)胞與組織間的廣泛信號(hào)途徑。研究證實(shí)，對(duì)GPCR功能的調(diào)節(jié)，有助于免疫學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、心臟病學(xué)與腫瘤學(xué)領(lǐng)域多種疾病的治療。
通過應(yīng)用新的基于細(xì)胞水平的受體功能檢測(cè)技術(shù)，候選藥物對(duì)新調(diào)節(jié)子的確認(rèn)率顯著提高，損耗率（定義為臨床前檢測(cè)/臨床試驗(yàn)失敗率）降低。但基礎(chǔ)研究獲得的GPCR 功能數(shù)據(jù)很難被應(yīng)用于臨床疾病中。造成這種情況的原因是，傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)往往（1）使用異源細(xì)胞，或相關(guān)性較低的細(xì)胞類型，進(jìn)行人造受體的過表達(dá)；（2） 使用外源性檢測(cè)試劑，如熒光標(biāo)記試劑；（3）使用侵入性處理手段，像染料負(fù)載以及細(xì)胞裂解，（4）生成的數(shù)據(jù)僅為單一時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，而不是持續(xù)性細(xì)胞監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。
    最近開發(fā)的生物相關(guān)性程度更高的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可顯著改善 GPCR 藥物開發(fā)與研究應(yīng)用的成功率(1)。羅氏應(yīng)用科學(xué)部的 xCELLigence 系統(tǒng)，不需要使用外源性標(biāo)記，即可對(duì)疾病相關(guān)細(xì)胞的內(nèi)源性GPCR功能進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)測(cè)。將細(xì)胞接種于含有微電極的培養(yǎng)板上，可對(duì)GPCR 激活導(dǎo)致的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的微小變化與細(xì)胞收縮情況進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。
    通過與細(xì)胞漿鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白或 G 蛋白結(jié)合偶聯(lián)，GPCRs 可進(jìn)行細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)。所有主要的與 G 蛋白偶聯(lián)的第二信使通路，都已被發(fā)現(xiàn)會(huì)激活環(huán)化AMP/蛋白激酶 A、鈣離子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。而xCELLigence 系統(tǒng)可通過記錄細(xì)胞阻抗，很容易對(duì)形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行檢測(cè)(2)，從而完成對(duì)GPCR的檢測(cè)。
    與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，形態(tài)學(xué)阻抗測(cè)定可對(duì)多個(gè)信號(hào)途徑累積效應(yīng)進(jìn)行捕獲。內(nèi)源性GPCR 功能測(cè)定的優(yōu)勢(shì)包括（1）對(duì)靶受體進(jìn)行評(píng)價(jià)是在其正常表達(dá)水平上；（2）在調(diào)節(jié)因子包括激素或異源性二聚體存在情況下，對(duì)受體之間的天然相互作用情況進(jìn)行分析；（3）允許 GPCR 與細(xì)胞內(nèi) G 蛋白的天然偶聯(lián)。同時(shí)，應(yīng)用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記xCELLigence 檢測(cè)系統(tǒng)，可動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)期間的所有阻抗信息，從而對(duì)所有GPCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。通過單一檢測(cè)即可對(duì) GPCR 激活導(dǎo)致的所有第二信使途徑進(jìn)行測(cè)定，從而有效降低試劑成本。
本研究中，我們發(fā)現(xiàn) xCELLigence 系統(tǒng)是一種靈敏的、可靠的檢測(cè)系統(tǒng)，用于持續(xù)內(nèi)源性 GPCR 功能測(cè)定。研究中我們對(duì)涉及 24 個(gè)治療相關(guān)受體家族的一組 43 個(gè)配體（參見表 1）進(jìn)行了測(cè)定，并生成了相關(guān)GPCR功能圖譜。實(shí)驗(yàn)涉及通用的腫瘤細(xì)胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 與 CHO-K1，以及疾病相關(guān)的原代細(xì)胞：人血管內(nèi)皮細(xì)胞與混合腎上皮細(xì)胞。

表 1：GPCR 功能圖概述

材料與方法
    細(xì)胞系與培養(yǎng)條件：細(xì)胞系來(lái)自于ATCC。按照 ATCC 的建議進(jìn)行HeLa（#CCL-2）、U2OS （#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1 （#CCL-61）、人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC；# PCS-100-010 批號(hào) 58570370）與混合腎原代上皮細(xì)胞（MREC；ATCC # PCS-400-012 lot # 58488854）的培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞系傳代至 10 代以上，原代細(xì)胞系傳代至 4 代。
    檢測(cè)程序：所有檢測(cè)均于組織培養(yǎng)器（5% CO2，37°C ）中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度是 1-2 x 104 細(xì)胞每孔，接種于96孔E-Plates 中，并通過xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行過夜監(jiān)測(cè)，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至接近滿板，復(fù)孔檢測(cè)。預(yù)先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 µl 藥物，并儲(chǔ)存于 -20℃。待細(xì)胞培養(yǎng) 18-24 小時(shí)后，進(jìn)行藥物稀釋反應(yīng)。將藥物融解，并添加 132 µl 檢測(cè)緩沖液（1 x HBSS，Sigma H8264、20mM HEPES，Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA，F(xiàn)isher Scientific #BP1600）對(duì)其進(jìn)行稀釋處理。從培養(yǎng)箱中移除 E-Plates 96，使用檢測(cè)緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌一次，并使用Biotek MicroFlo Select，于每孔中添加 140 µl 檢測(cè)緩沖液。將 E-Plates 96 放回至RTCA MP 站，放置15 分鐘，進(jìn)行細(xì)胞平衡。然后使用 Beckman Multimek 96，同時(shí)在各孔添加10 µl的藥物緩沖液。小分子藥物實(shí)驗(yàn)最終濃度為10 µM，多肽為1 µM。
    數(shù)據(jù)分析：使用 RTCA 軟件，對(duì)每孔的數(shù)據(jù)在藥物添加前時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對(duì)于各種藥物，在計(jì)算時(shí)需減去只含藥物溶劑時(shí)對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出的背景值。小分子藥物相應(yīng)溶劑為DMSO，多肽藥物相應(yīng)溶劑為0.1% 的BSA 。
    將檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Microsoft Excel，進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。確定每孔細(xì)胞的最大與最小細(xì)胞指數(shù)值，計(jì)算重復(fù)檢測(cè)（n=2）的均值標(biāo)準(zhǔn)差與平均值。對(duì)于對(duì)照孔細(xì)胞來(lái)說，對(duì)重復(fù)檢測(cè) 8 個(gè)孔的均值標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行測(cè)定。將這些數(shù)值平均并乘以 3 以計(jì)算“hit”閾值。對(duì)于 Z 因子與 EC50 計(jì)算來(lái)說，使用RTCA MP提供的動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線，選擇一時(shí)間點(diǎn)作為細(xì)胞系及藥物綜合反應(yīng)的最佳時(shí)間點(diǎn)。

結(jié)果
    為確保研究的重現(xiàn)性，細(xì)胞為可靠來(lái)源，并可確保細(xì)胞的質(zhì)量與類別。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均來(lái)自于美國(guó)細(xì)胞菌種庫(kù)（ATCC）。檢測(cè)前，進(jìn)行有限傳代，按照 ATCC 的建議進(jìn)行細(xì)胞的保存。
內(nèi)源性GPCR檢測(cè)穩(wěn)定性。檢測(cè)各種條件下HeLa細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性GPCRs激活劑的反應(yīng)性。且將鈣離子載體 A23187作為陽(yáng)性對(duì)照，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。低濃度情況下，由于 Gq-偶聯(lián) GPCR 的激活，A23187可模擬鈣離子的活化過程。由于其獨(dú)立于GPCRs的表達(dá)，這種反應(yīng)有助于細(xì)胞檢測(cè)條件的研發(fā)。最強(qiáng)烈反應(yīng)出現(xiàn)于過夜長(zhǎng)滿平板的細(xì)胞。此時(shí)使用 GPCR 檢測(cè)通用緩沖液更換掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基（參見詳細(xì)檢測(cè)條件中的材料與方法）。
    按照這些檢測(cè)條件對(duì)幾種不同細(xì)胞系對(duì) A23187 與1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，SIP 是無(wú)所不在的 GPCR 表達(dá)家族、溶血磷脂或內(nèi)皮分化基因（EDG）受體的內(nèi)源性激活劑。Z量測(cè)因子考慮有信噪比與檢測(cè)的變異性，用于對(duì)檢測(cè)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)(3)。使用終濃度 1 µM 或與緩沖試劑（0.1% BSA）相同濃度的 S1P 與 終濃度 100 nM 或與其緩沖試劑（DMSO）相同濃度的 A23187 對(duì) 8 個(gè)重復(fù)多孔培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行處理。使用xCELLigence 系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，間隔時(shí)間1分鐘。
    激活劑添加后最初幾分鐘期間，即開始檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)。每種細(xì)胞系中，添加激活劑后的最初 30-40 分鐘期間細(xì)胞反應(yīng)最大（參見圖 1）。如圖所示，處理后接近 30 分鐘時(shí)，HeLa 細(xì)胞對(duì)A23187 的反應(yīng)最大，對(duì)S1P 的反應(yīng)接近最大。此時(shí)，A23187 與 S1P 的 Z 因子分別是0.83與 0.90。所檢測(cè)的細(xì)胞類型中，兩種處理中至少一種 Z 因子分值超出0.5，表明檢測(cè)可靠性高（參見表 2）。相反，兩種配體混合的原代腎上皮細(xì)胞（RMEC） Z 因子接近 0.25，表明檢測(cè)可靠性不顯著。但后續(xù) GPCR 篩查檢測(cè)結(jié)果表明，該細(xì)胞類型其他 GPCRs 可靠性更高。

圖 1：GPCR 檢測(cè)可靠性評(píng)價(jià)。HeLa 細(xì)胞接種密度是 10000 細(xì)胞每孔，接種于E-Plate 96 上，放置于xCELLigence RTCA MP 儀器，并在培養(yǎng)箱中過夜。然后去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，添加檢測(cè)緩沖液，持續(xù)細(xì)胞監(jiān)測(cè) 15 分鐘后，添加 GPCR調(diào)節(jié)藥物，記錄每分鐘細(xì)胞反應(yīng)情況，記錄 1.5 小時(shí)。獲得時(shí)間依賴性細(xì)胞反應(yīng)曲線。八復(fù)孔，誤差列代表均值標(biāo)準(zhǔn)差。藥物添加后 30 分鐘，計(jì)算單一時(shí)間點(diǎn) Z 因子值檢測(cè)質(zhì)量。DMSO 是 A23187 試劑對(duì)照；0.1% BSA 用于 S1P。SD = 標(biāo)準(zhǔn)差；ABS = 絕對(duì)值。

圖 2：GPCR 檢測(cè)靈敏性評(píng)價(jià)。如圖 1 方法，對(duì) HeLa 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，每種藥物以8個(gè)濃度處理細(xì)胞。使用 RTCA 軟件，通過計(jì)算藥物添加30分鐘后每種藥物的EC50值，對(duì)檢測(cè)靈敏性進(jìn)行測(cè)定。

    內(nèi)源性GPCR檢測(cè)靈敏性。我們也使用 A23187 與 S1P，以及 8 點(diǎn)劑量反應(yīng)曲線檢測(cè)實(shí)驗(yàn)靈敏性（參見圖 2）。于 Z 因子測(cè)定相同時(shí)間點(diǎn)，通過 RTCA 軟件計(jì)算產(chǎn)生 50% 最大反應(yīng)（EC50 值）的激活劑濃度。
    每種細(xì)胞系的 EC50 值見表 2。每種細(xì)胞對(duì) A23187 的處理均比較敏感，除CHO-K1外，所有細(xì)胞類型對(duì) S1P 的處理均非常敏感，產(chǎn)生的 EC50 值低限為 10-7 至 10-9。盡管 CHO-K1 細(xì)胞表達(dá)EDG 受體(4)，后續(xù)檢測(cè)S1P 與溶血磷脂酸（LPA）反應(yīng)分值為陽(yáng)性（見下文），但是為生成準(zhǔn)確的 EC50，很明顯，這里所用的劑量不足以飽和生物反應(yīng)。

表 2：檢測(cè)開發(fā)與評(píng)價(jià)概述

    內(nèi)源性GPCR功能圖。優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)后，使用治療相關(guān) GPCRs 的一組 43 個(gè)小分子與多肽調(diào)節(jié)子，對(duì)本研究中所用的細(xì)胞類型的功能反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)（參見表 1）。該組藥物指向的24 個(gè)受體家族，包括 50種潛在性反應(yīng)受體，代表所有主要的 GPCR 偶聯(lián)類型（Gs、Gi、Gq、G12/13）。使用上文程序進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)各細(xì)胞類型。
    四種腫瘤細(xì)胞系HeLa、CHO-K1、U2OS 與 SH-SY5Y 對(duì)每種藥物都會(huì)生成獨(dú)特的時(shí)間依賴性細(xì)胞曲線（time-dependent cellular response profile，TCRP）（數(shù)據(jù)未顯示）。我們對(duì)每孔最大與最小細(xì)胞指數(shù)值進(jìn)行測(cè)定，該指數(shù)值與時(shí)間點(diǎn)無(wú)關(guān)，并以該數(shù)值均值與標(biāo)準(zhǔn)差作圖（參見圖 3）。GPCR 功能圖表明，對(duì)能引發(fā)反應(yīng)的配體而言，細(xì)胞指數(shù)值的增加或降低具有顯著差異。例如，HeLa 細(xì)胞顯示的細(xì)胞指數(shù)正向改變程度較大，CHO-K1 細(xì)胞顯示的細(xì)胞指數(shù)負(fù)向改變程度較大，包括同樣受體家族中的 GPCRs，如PGE1、2 與 Iloprost 激活前列腺素類受體（參見圖 3）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞背景差異可顯著改變對(duì)同樣刺激物的形態(tài)學(xué)反應(yīng)，這可能是由于 G 蛋白偶聯(lián)的差異，或下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的差異，這些差異可使細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。細(xì)胞指數(shù)值的總體模式同樣也可反映出不同 GPCR 配體的相對(duì)特異性。SDF1a，即 CXCR4 內(nèi)源性激活劑，僅可于 HeLa細(xì)胞中，誘導(dǎo)出強(qiáng)大的正向細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)，而降鈣素僅可誘導(dǎo)出 CHO-K1 細(xì)胞的強(qiáng)大的負(fù)向細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)。我們也對(duì)兩種附加腫瘤細(xì)胞系：SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤與 U2OS骨肉瘤細(xì)胞，以及兩種原代細(xì)胞類型：人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）與混合原代腎上皮細(xì)胞（這里簡(jiǎn)稱 MREC）的 GPCR 配體進(jìn)行檢測(cè)。
    為測(cè)定細(xì)胞系的相應(yīng)活性配體，我們將 8 個(gè)對(duì)照孔的最大與最小細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)值與固有變異性進(jìn)行比較。細(xì)胞指數(shù)值超出或低于對(duì)照孔細(xì)胞檢測(cè)值的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的檢測(cè)孔細(xì)胞被視為呈活性反應(yīng)。配體誘導(dǎo)活性反應(yīng)見圖3 與 4。每種細(xì)胞相應(yīng)內(nèi)源性 GPCR 見表 1。
    一種或更多細(xì)胞類型中，有14種受體家族被確認(rèn)為活性反應(yīng)。多種情況下，本研究中使用的內(nèi)源性配體可激活同樣受體家族的多個(gè)成員。例如，血清素可激活所有內(nèi)源性血清素受體，包括幾種亞家族，其中幾種亞家族具有多種亞型�？傊�，研究證實(shí)，對(duì)一種或更多的腫瘤細(xì)胞，以及本研究所用的原代細(xì)胞中，xCELLigence系統(tǒng)細(xì)胞指數(shù)圖是一種可靠的方式，可用于對(duì) 14 種不同 GPCR 家族進(jìn)行功能檢測(cè)。

圖 3：腫瘤細(xì)胞系 GPCR 功能圖。指定類型細(xì)胞的檢測(cè)如圖 1 所示，于反應(yīng)板單孔中，對(duì)細(xì)胞添43 個(gè)GPCR調(diào)節(jié)藥物后的反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)行復(fù)孔重復(fù)。測(cè)定每孔最大與最小的細(xì)胞指數(shù)值（參見材料與方法）。使用 RTCA 軟件，減去每時(shí)間點(diǎn)緩沖液對(duì)照孔的平均基線細(xì)胞指數(shù)值，從而對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（參見詳細(xì)文本說明）。因此對(duì)照孔細(xì)胞指數(shù)值為零。誤差列代表監(jiān)測(cè)時(shí)間窗內(nèi)培養(yǎng)孔的標(biāo)準(zhǔn)差。以反應(yīng)孔的處理細(xì)胞的重復(fù)多個(gè)細(xì)胞指數(shù)值（兩個(gè)重復(fù)多個(gè)反應(yīng)板，n=2）均值作圖。誤差列代表重復(fù)多個(gè)細(xì)胞指數(shù)值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。紅色虛線代表對(duì)照孔的3倍標(biāo)準(zhǔn)差。明確導(dǎo)致細(xì)胞指數(shù)值增加（綠色線）或降低（紅色線）的藥物以實(shí)線框加強(qiáng)；無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)（低于3倍標(biāo)準(zhǔn)差-臨界值）以虛線框顯示。

圖 4：原代細(xì)胞 GPCR 功能圖。如圖 3 所示，對(duì)指定細(xì)胞類型的原代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

討論
    xCELLigence系統(tǒng)的實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)可加速藥物開發(fā)進(jìn)程，并使基礎(chǔ)研究成果更快的應(yīng)用至臨床中。我們的研究顯示，通過 xCELLigence 系統(tǒng)，可對(duì)腫瘤細(xì)胞系與原代細(xì)胞的 GPCRs 功能進(jìn)行檢測(cè)。目前研究顯示，一種或更多的細(xì)胞系中，檢測(cè)的大多數(shù)受體靶 GPCR 家族可產(chǎn)生穩(wěn)定反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)度高于對(duì)照孔細(xì)胞均值的三倍標(biāo)準(zhǔn)差。以同樣方式對(duì)多種細(xì)胞類型進(jìn)行檢測(cè)，除本文列出外，還可發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)源性 GPCR檢測(cè)數(shù)量。已檢測(cè)的部分配體可激活 GPCR 家族多個(gè)成員。通過所選基因表達(dá)圖的激動(dòng)劑與拮抗劑附加實(shí)驗(yàn)，以及單一受體siRNA 敲除檢測(cè)，可對(duì)xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)到的，引發(fā)形態(tài)學(xué)改變的特異性受體亞型進(jìn)行確認(rèn)。

結(jié)論
• xCELLigence 系統(tǒng)可對(duì)廣泛的內(nèi)源性 GPCRs 功能進(jìn)行檢測(cè)。
• xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行的GPCR 檢測(cè)，靈敏性與穩(wěn)定性非常高。
• xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行的GPCR 檢測(cè)GPCR 檢測(cè)，可用于癌細(xì)胞系與原代培養(yǎng)細(xì)胞系。

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