雌激素受體ERα的降解是治療乳腺癌的一種有效策略。然而，耐藥性問題限制了其效用，因此有必要開發(fā)下一代ERα靶向治療方法。雙特異性降解物（PROTAC）由于可同時(shí)結(jié)合靶蛋白（POI）和E3連接酶，高效催化靶蛋白的泛素化降解，近年來已成為一項(xiàng)很有前途的藥物開發(fā)新策略。靶標(biāo)結(jié)合配體的設(shè)計(jì)是PROTAC開發(fā)十分重要的環(huán)節(jié)。DNA編碼化合物文庫（DECL）篩選可能是鑒定此類新型配體的最佳選擇。

在此背景下，美國X-Chem公司在Journal of Medical Chemistry發(fā)表了題為Bispecific Estrogen Receptor α Degraders Incorporating Novel Binders Identified Using DNA-Encoded Chemical Library Screening的文章。作者報(bào)告了一種新的ERα結(jié)合物和拮抗劑篩選流程：通過靶向ERα WT（野生型）和3個(gè)功能獲得(GOF)突變體，基于DECL技術(shù)篩選了約1200億個(gè)DNA編碼分子，實(shí)現(xiàn)以最少的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)一系列新的ERα雙特異性降解物（PROTACs）。
 

1 DNA編碼化合物文庫的親和篩選
作者首先對(duì)1200億的DNA化合物文庫進(jìn)行親和篩選。將44種不同的DNA編碼化合物文庫組合，分別與無目標(biāo)物、ERα WT配體結(jié)合域LBD（濃度7.7 μM-24 nM）、ERα WT（7.7 μM，含雌二醇15 μM）以及每種ERα突變體D538G、S463P和Y537S（均為7.7 μM）進(jìn)行孵育。經(jīng)一系列捕獲、洗滌、洗脫、富集后進(jìn)行測(cè)序。在所有44個(gè)文庫中，共計(jì)產(chǎn)生5.28億個(gè)單端reads，每個(gè)文庫每種選擇條件下的平均reads為120萬個(gè)。

2 選擇輸出數(shù)據(jù)及Hit ID
將各個(gè)序列reads翻譯成對(duì)應(yīng)的構(gòu)建單元，隨后計(jì)算各選擇條件下、每個(gè)庫中所有構(gòu)建單元組合的的富集概況以及各個(gè)構(gòu)建單元組合共同富集的程度。如圖2a,b顯示，作者找到兩個(gè)獨(dú)立的構(gòu)建單元對(duì)（雙合成子），用作系列建立的起點(diǎn)化合物或hits。其在7.7和1.6μM ERα條件下均顯著富集、與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)，且對(duì)Y537S和S463P突變體也有顯著富集，可見其在配體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。
 

圖2.（a,b）兩個(gè)代表性構(gòu)建單元結(jié)構(gòu)及其富集示意圖（c）兩個(gè)最具效力的off-DNA化合物結(jié)構(gòu)及其熒光偏振結(jié)合位移測(cè)定

3 Hit驗(yàn)證及其SAR研究
未驗(yàn)證輸出選擇，進(jìn)行代表性off-DNA化合物的合成，并通過體外生物化學(xué)FP（熒光偏振）、對(duì)ER+細(xì)胞系MCF7在拮抗和激動(dòng)模式下的增殖測(cè)定，以及在MCF7細(xì)胞中對(duì)PROTACs進(jìn)行In-cell Western的ERα降解測(cè)定（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，Azure Biosystems），鑒定出上述兩個(gè)構(gòu)建單元對(duì)的兩個(gè)最具效力的代表性off-DNA化合物（1和2），如圖2c所示。

在DECL篩選數(shù)據(jù)和分子對(duì)接的指導(dǎo)下，作者設(shè)計(jì)、制備并評(píng)估了體外小分子的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系（SAR），將其中具有顯著強(qiáng)效拮抗作用，且未觀察到細(xì)胞激動(dòng)作用的化合物7作為雙特異性PROTAC的一部分進(jìn)一步改造。

4 ERα強(qiáng)效結(jié)合PROTAC的結(jié)合物開發(fā)
作者利用已知的ERα結(jié)合劑巴多昔芬，探索不同E3配體和連接體長(zhǎng)度對(duì)ERα結(jié)合降解的影響。基于化合物7，1,3-偶極環(huán)加成制備了7種基于沙利度胺的化合物，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中均為有效，其中11-14具有亞微摩爾細(xì)胞降解 (表2)。更進(jìn)一步，基于VHL配體，設(shè)計(jì)制備了具有三個(gè)連接長(zhǎng)度的PROTACs陣列。

表2. 利用巴多昔芬或化合物7組成部分作為POI配體的PROTACs
 

a原始分析. b48 h. c24 h. d6 h. e16 h.

5 ERα抑制降解的作用機(jī)制及動(dòng)力學(xué)研究
對(duì)于其中最有效的兩個(gè)VHL變體(18和21)的PROTACs，在MCF7細(xì)胞中進(jìn)行In-cell Western降解試驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，Azure Biosystems），結(jié)果顯示在24 h時(shí)，兩種化合物的ERα水平呈劑量依賴性降低，21的降解能力強(qiáng)于18（補(bǔ)充圖S2)。MCF7細(xì)胞活力測(cè)定顯示，激動(dòng)劑作用可忽略不計(jì)，而兩種化合物都顯示出強(qiáng)大的拮抗活性。
 

圖S2. PROTACs在MCF7細(xì)胞中抑制并降解Erα。In-cell western 實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像儀拍攝）中的化合物18和21劑量反應(yīng)曲線

為評(píng)估PROTAC介導(dǎo)的ERα降解動(dòng)力學(xué)，作者在時(shí)程實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行Western Blot（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，Azure Biosystems）。結(jié)果顯示， PROTAC的降解劑18效果早在2小時(shí)就可看到強(qiáng)烈的、近乎完全的降解(圖4a)，顯著優(yōu)于富維司�。�4小時(shí)后出現(xiàn)降解，無完全降解）。E3結(jié)合劑VHL-298競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)(圖4c) ，以及陰性對(duì)照（18的VHL脯氨醇差向異構(gòu)體23）實(shí)驗(yàn)均證明，蛋白酶介導(dǎo)的ERα降解需要vhl參與(圖4c) 。
 

圖4. 富維司汀及PROTACs 18、21在MCF7細(xì)胞中抑制和降解ERα。

在另一種ER陽性細(xì)胞系T47D中Western Blot（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，Azure Biosystems），測(cè)試ERα PROTACs 18和21。結(jié)果與MCF7細(xì)胞系相似，在T47D細(xì)胞中觀察到明顯的ERα降解 (圖5a)。作者隨后用劑量遞增的ERα PROTACs 18和21處理各類乳腺癌細(xì)胞系7天。結(jié)果顯示所有ER+細(xì)胞系均存在活力缺陷，而ER陰性MBA-MB 231和永生化的乳腺細(xì)胞系MCF10A未見有活力影響（圖5b）。證實(shí)了這一新型ERα PROTACs系列的在靶（on target）效應(yīng)。
 

圖5. (a) 18和21在MCF7和T47D細(xì)胞系的ERα降解（b）ERα PROTACs在各類乳腺癌細(xì)胞系中的在靶作用

6 體外ADME和PK
總體而言，基于VHL的酰胺和苯氧基化合物17-22是ER+細(xì)胞系中ERα的有效降解劑。選擇連接鏈較短的化合物17、18、20和21進(jìn)一步研究（表3）。在體內(nèi)，VHL苯氧基化合物20和21的靜脈注射清除率遠(yuǎn)低于VHL酰胺17和18，且前者分布體積也遠(yuǎn)低于后者，故20、21的暴露量高于17、18�？诜�給藥18和21時(shí)觀察到的暴露量最小，但仍表現(xiàn)出強(qiáng)大的降解活性和顯著的血漿暴露，且在皮下給藥時(shí)具有不同的PK特征，因此值得在體內(nèi)評(píng)估ERα的降解情況。

表3. 雄性CD1小鼠中選定化合物的體外清除率和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)（PK）
 

7 體內(nèi)療效研究
化合物21皮下注射10 mg/kg也具有顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果，TGI= 84.3%，p < 0.001�；�合物18對(duì)腫瘤體積的影響較小，因此在第20天停止給藥（圖6a）。終點(diǎn)PK分析顯示，血漿和腫瘤中的暴露與體內(nèi)觀察到的療效密切相關(guān)，化合物21的暴露量遠(yuǎn)高于18（圖6c,d）。Western Blot結(jié)果表明（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)，Azure Biosystems），所有治療組的ERα水平均有所降低（圖6e）。這些結(jié)果清楚地表明，化合物21是在體內(nèi)外抑制和降解ERα的優(yōu)秀工具化合物。
 

圖6. 體內(nèi)療效和PK/PD研究表明MCF7異種移植模型有效。(a) 18、21與富維司汀的抗腫瘤活性對(duì)比。(b)所有化合物耐受性良好，體重?zé)o變化。(c, d) 末次給藥3 h 后18和21的終末血漿PK和腫瘤PK (e) Western blot（Sapphire激光掃描系統(tǒng)拍攝）顯示18、21及富維司汀治療后的ERα水平降低。

8 總結(jié)
DNA編碼化合物文庫（DECL）作為設(shè)計(jì)PROTACs的篩選平臺(tái)具有顯著優(yōu)勢(shì)�；�于此，本文設(shè)計(jì)、優(yōu)化、制備了一組有效的Erα雙特異性降解物，是進(jìn)一步開發(fā)基于ERα的PROTACs乳腺癌治療藥物的價(jià)值工具。

原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jmedchem.1c00127