神經(jīng)元使用不同的蛋白質(zhì)組合建立突觸接觸，從而定義突觸的特異性、功能和可塑性潛力，為學(xué)習(xí)和記憶的形成提供了分子基礎(chǔ)。越來越多的證據(jù)顯示，突觸在結(jié)構(gòu)和功能上有很大的多樣性。然而，突觸蛋白質(zhì)組的多樣性在很大程度上仍未可知。

近日，德國(guó)馬克斯-普朗克研究所在Cell上發(fā)表了題為The proteomic landscape of synaptic diversity across brain regions and cell types的文章。作者從7個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系、5個(gè)不同腦區(qū)中分離出18種不同突觸類型的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了1800種獨(dú)特的突觸類型豐富的蛋白質(zhì)。作者鑒定了共享的突觸蛋白模塊及蛋白質(zhì)組學(xué)熱點(diǎn)，并提供了突觸蛋白質(zhì)組學(xué)與細(xì)胞或電路水平結(jié)合的研究框架。
 

1 蛋白質(zhì)組量化的流程開發(fā)
作者使用熒光激活的突觸體分選（FASS）制備純化突觸體，并耦合質(zhì)譜儀進(jìn)行定量 (圖1A),開發(fā)了一套簡(jiǎn)化的工作流程，用于量化不同腦區(qū)、不同細(xì)胞類型突觸的蛋白質(zhì)組區(qū)域。將Gad2-cre（皮層抑制性）及Camk2acre（皮層興奮性）品系與SypTOM品系雜交（圖1A），主成分分析(PCA)顯示與未分選的突觸體的具有顯著差異(圖1C、1D、S1H和S1I)。定量顯示，其富集程度最高的蛋白質(zhì)幾乎完全代表著現(xiàn)有的皮層興奮性/抑制性突觸標(biāo)記蛋白(圖1D和1E)。Camk2a::SypTOM中富集程度最高的20個(gè)蛋白中，有19個(gè)已在SynGO數(shù)據(jù)庫有注釋。證明此工作流程可從少量純化的突觸體中識(shí)別突觸蛋白。
 

圖1. 突觸多樣性、蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)流程及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(A)蛋白組量化的工作流程圖(B) FASS等高線圖。(C) Camk2a+與Gad2+突觸體蛋白組的PCA分析。(D) Camk2a+及Gad2+突觸體與對(duì)照突觸體前體的蛋白富集差異散點(diǎn)圖。(E) Camk2a+ (石灰綠色)與Gad2+突觸體(玫瑰色)顯著富集蛋白比對(duì)的火山圖

2 流程應(yīng)用及數(shù)據(jù)查詢工具
作者隨后將上述流程應(yīng)用于來自5個(gè)不同腦區(qū)、4種Cre小鼠模型的15種不同主要突觸亞型的蛋白質(zhì)組學(xué)多樣性研究。結(jié)果顯示，不同腦區(qū)Camk2a::SypTOM及Gad2::SypTOM突觸體的特異性有差別。但在突觸體豐度、突觸囊泡的大小或存在、突觸線粒體或腦區(qū)之間的突觸后結(jié)構(gòu)方面無差異。PCA分析顯示，與腦區(qū)相比，細(xì)胞類型對(duì)突觸蛋白質(zhì)組的影響更大。

作者共鑒定了15個(gè)突觸蛋白質(zhì)組超10,000種蛋白組，其中80%為syngo已注釋蛋白，富集蛋白組>1,800種，并創(chuàng)建了一個(gè)交互式網(wǎng)絡(luò)工具 (The Synaptic Diversity Hub, https://syndive.org/)，可供查詢探索 。

3 胞吞/胞吐作用蛋白的富集特性
在幾乎所有突觸類型中，突觸囊泡泡atp酶(vATPases)以及介導(dǎo)突觸囊泡內(nèi)吞作用的蛋白質(zhì)顯著富集(定義為共享蛋白)。在所有腦區(qū)，Gad2:: sytom與Camk2a:: sytom富集蛋白很少重疊(約1%)。

某些蛋白家族如Rab、Vamp、Stx或Syt家族成員在興奮性（Camk2a）或抑制性（Gad2）突觸上表現(xiàn)出不同的富集特征。隨后對(duì)這些蛋白質(zhì)的一個(gè)子集進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，采用Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝（Azure Biosystems）。結(jié)果顯示，Vamp1, complexin-1/2, Syt2在Camk2a中相較于Gad2顯著富集，而Syt12, Stx1a則在Gad2中更顯著富集，證實(shí)了這些數(shù)據(jù)(圖S4C-S4E)。免疫印跡和質(zhì)譜分析之間有很好的相關(guān)性(Pearson’s r=0.95)。這種多樣性表明，這些蛋白質(zhì)可能以不同的方式調(diào)節(jié)相同的突觸分子過程。
 

圖S4.突觸蛋白的共享和亞型特異性富集(C)免疫印跡驗(yàn)證（Sapphire 激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）。(D)免疫印跡定量直方圖。(E)免疫印跡與質(zhì)譜分析相關(guān)圖。

而在CX和HC中，>95%的CAMs（細(xì)胞粘附分子）僅富集于興奮性或抑制性突觸蛋白質(zhì)組，具有高度的細(xì)胞類型特異性。綜上，內(nèi)吞作用和vATPases使用通用的突觸蛋白模塊，不因神經(jīng)遞質(zhì)類型而異；而胞吐機(jī)制、突觸前活躍區(qū)等則使用類型特異的蛋白質(zhì)組。

4 VGlut1及vGat相關(guān)蛋白組研究
作者將所有蛋白質(zhì)模塊與突觸亞型的特征相關(guān)聯(lián)，揭示了具有兩個(gè)不同對(duì)立簇的蛋白-蛋白相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，分別具有與VGlut1或vGat高度相關(guān)或負(fù)相關(guān)的特征，代表不同細(xì)胞類型和大腦區(qū)域中與興奮性或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)組。作者鑒定出188個(gè)和315個(gè)與VGlut1或vGat表達(dá)顯著相關(guān)的蛋白，找到位于群落連接節(jié)點(diǎn)的核心蛋白(圖4D) ，以及可能區(qū)分特定突觸亞型的中度相關(guān)蛋白。另外發(fā)現(xiàn)130種與vGat表達(dá)以及158種與VGlut1表達(dá)顯著相關(guān)的新突觸蛋白。

基因集富集分析(GSEA)表明，vGat和VGlut1蛋白群落具有特異的富集途徑或生物功能：VGlut1群落中突觸后信號(hào)通路和樹突棘相關(guān)蛋白顯著富集(圖4F) 。vGat群落中，GABA受體復(fù)合物的蛋白顯著富集。鑒定出皮層和海馬體中的22對(duì)蛋白質(zhì)對(duì)，在興奮性和抑制性突觸中的富集呈顯著負(fù)相關(guān) (圖4G, 4H) 。并發(fā)現(xiàn)一些新蛋白，可能在相同的突觸分子過程中，參與調(diào)節(jié)突觸的類型特異性。
 

圖4.突觸蛋白-蛋白相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(D)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)與vGat免疫反應(yīng)(上)及VGlut1免疫反應(yīng)(下)的相關(guān)性(E) 與vGat免疫熒光顯著相關(guān)模塊中的蛋白質(zhì)。(F) VGlut1和vGat蛋白群落富集通路的脊圖。(G)皮層和海馬Camk2a+和Gad2+突觸蛋白質(zhì)組中負(fù)相關(guān)蛋白對(duì)的熱圖。(H)負(fù)相關(guān)蛋白對(duì)的相關(guān)圖。

5 帕金森及罕見突觸類型的研究應(yīng)用
為研究特異性與共享多巴胺能突觸蛋白（其退化與帕金森密切相關(guān)），作者鑒定了在紋狀體中，多巴胺能突觸相比于其他14種突觸類型的突觸蛋白富集情況。顯示多巴胺能突觸中缺乏Oxr1可能導(dǎo)致氧化損傷的易感性(例如，在帕金森病期間)。而蛋白激酶Erk1 (Mapk3)通過在多巴胺能突觸的特異性富集與帕金森病相關(guān)。相對(duì)于紋狀體Syn1:: sytom突觸，Dat:: sytom突觸蛋白質(zhì)組富集了參與多巴胺生物合成、運(yùn)輸和降解的關(guān)鍵蛋白。免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn) (圖S6B)。此外，共享富集的蛋白包括vATPases、蛋白酶體亞基和內(nèi)吞蛋白(圖5F和S6C)。
 

圖S6.多巴胺能蛋白組分析(B)驗(yàn)證Oxr1、Mapk3和Atp6v1g1在Dat+及Syn1+突觸的富集或去富集。(C)突觸前末端的Dat+和Syn1+突觸中富集的選定蛋白。(D)突觸體制備的不同組分的SDS-PAGE和免疫印跡。(E)原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元PSME1免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的免疫印跡。(F)小鼠紋狀體F2/3組分和純化的20Si蛋白酶體的SDS-PAGE。圖B、D、E、F均為Sapphire拍攝。

此技術(shù)流程同樣可用于研究小分支或罕見細(xì)胞的突觸類型。例如，作者成功的量化了Gad2:: sytom的抑制性突觸蛋白質(zhì)組。又在對(duì)皮質(zhì)GABA能神經(jīng)元亞類的研究中，分選得到的VIP+、PV+和SST+突觸體（分別僅占所有顆粒的0.5%、3%、5%）的純度均＞80%，且成功檢測(cè)出其蛋白的富集。進(jìn)一步分析顯示，細(xì)胞類型的發(fā)育起源對(duì)皮質(zhì)抑制性突觸蛋白質(zhì)組的影響不大。最后，作者發(fā)現(xiàn)了共600種與這三種抑制性突觸類型的功能差異相關(guān)的蛋白質(zhì)。

6 總結(jié)
本研究開發(fā)了一套突觸蛋白組的分子系統(tǒng)生物學(xué)分析框架。預(yù)計(jì)類似的實(shí)驗(yàn)策略可用于突觸的多組學(xué)分析，研究其他生物分子(如聚糖、脂質(zhì)或RNA)的突觸多樣性。未來，突觸蛋白組也可與局部轉(zhuǎn)錄組整合描述RNA定位和局部翻譯在突觸蛋白質(zhì)組多樣性中的作用。此外，Cre/ lox系統(tǒng)等方法也將啟發(fā)在細(xì)胞水平的研究。

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