CRISPR-Cas系統(tǒng)由于具有高度可編程性和靈活性，被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)RNA敲降和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。然而，Cas13效應(yīng)物的大尺寸及在激活后的非特異性RNA切割，限制了Cas13系統(tǒng)基于腺相關(guān)病毒的的治療應(yīng)用。

近日，美國(guó)萊斯大學(xué)在Nature Communication上發(fā)表了題為Structural basis for the activation of a compact CRISPR-Cas13 nuclease的研究文章，報(bào)告了一種適合腺相關(guān)病毒傳遞的緊湊型Cas13 (Cas13bt3)的詳細(xì)生化和結(jié)構(gòu)特征，并對(duì)其體內(nèi)工程化應(yīng)用進(jìn)行了有效探索。

1 Cas13bt3活性的生化表征
基于體外RNA切割凝膠試驗(yàn)（Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)拍攝），作者首先設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有30 nt間隔的crRNA，用于檢測(cè)Cas13bt3對(duì)target RNA和非特異性RNA的活性。Cas13bt3在缺乏crRNA的情況下無活性，而crRNA結(jié)合激活Cas13bt3可有效切割122nt的target RNA(T0)(圖1b)。有趣的是，與常規(guī)的cas13表現(xiàn)不同，激活的Cas13bt3復(fù)合物（Cas13bt3復(fù)合物+crRNA+完全匹配的target RNA(T1)）的旁支切割（collateral cleavage）活性很低，其表現(xiàn)為針對(duì)poly-U reporter RNA的外切酶切割模式 (U20，圖1c, f) 。

另一方面，激活的Cas13bt3有效地切割了一個(gè)36 nt的ssRNA (ssRNA36)，可能圍繞著ssRNA36中存在的“UUC”序列(補(bǔ)充圖1a, b)。作者隨后設(shè)計(jì)了一系列短的10 nt ssRNA reporter，每個(gè)reporter具有一個(gè)核苷酸變異(R1-5，圖1f)。在電泳和熒光分析實(shí)驗(yàn)（基于Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)）中，Cas13bt3可在“UUC”位點(diǎn)有效切割R1底物 (圖1d, e, f，補(bǔ)充圖1c)，但不能切割poly-A10、poly-C10和poly-G10，且U10表現(xiàn)出與poly-U20 reporter RNA相同的低外切酶活性(圖1c，補(bǔ)充圖1d)。

可見，僅具有UC基序的底物才能被激活的Cas13bt3有效切割(圖1g)。

圖1. Cas13bt3切割的生化表征。a. Cas13bt3靶切及旁支切割活性圖。b. 有無crRNA時(shí)，Cas13bt3(12.5 ~ 200 nM)靶向切割122nt target RNA (T0)。c, d. 12.5-200 nM活化Cas13bt3復(fù)合物旁支切割U20底物(c)和R1底物(d)。e激活的Cas13bt3(50 nM)旁支切割不同序列Reporter RNA (R1-R5)。f. 旁支切割實(shí)驗(yàn)使用的Reporter RNA序列。g. 激活的Cas13bt3(50 nM)旁支切割16種可能組合的Reporter RNA。

Cas13bt3激活對(duì)target長(zhǎng)度有依賴。將target長(zhǎng)度從30nt逐漸降至21nt后，旁支切割活性隨之逐漸降至6%，30nt左右長(zhǎng)度的target才能完全激活Cas13bt3。此前報(bào)道的Cas13bt3結(jié)構(gòu)可能只是活化的中間態(tài) (Cas13bt3^Int，target長(zhǎng)度20nt) 。

2 活化Cas13bt3的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡下，Cas13bt3^Act（真正激活態(tài)的Cas13bt3-crRNA-hpRNA三元復(fù)合物，target長(zhǎng)度30nt，見圖2d）顯示為二裂片結(jié)構(gòu)，REC lobe和NUC lobe分別位于spacer/target dsRNA兩端，由兩個(gè)IDL(結(jié)構(gòu)域間連接物)連接。REC lobe位于target 5’端，由Helical1、 Helical2及Lid 構(gòu)成，用于識(shí)別DR (圖2f，補(bǔ)充圖s) 。NUC lobe由HEPN1和HEPN2結(jié)構(gòu)域組成，位于spacer/target dsRNA遠(yuǎn)端。與Cas13bt3-crRNA 二元復(fù)合物（Cas13bt3^Bin）和Cas13bt3^Int相比，REC lobe和NUC lobe發(fā)生很大的構(gòu)象變化。REC lobe對(duì)齊后，Cas13bt3Act中NUC lobe的質(zhì)量中心相比于前兩者，分別移動(dòng)了~40 Å和20 Å，旋轉(zhuǎn)了34度和19度。HEPN結(jié)構(gòu)域發(fā)生顯著的剛性運(yùn)動(dòng)，IDL1和IDL2的構(gòu)象也發(fā)生了劇烈的變化 (圖3e, f) 。
 

3 spacer/target dsRNA識(shí)別的分子基礎(chǔ)
在Cas13bt3Act中，直接的蛋白質(zhì)- RNA接觸(距離< 3.5 Å)是分散的。在target的5′端，來自Helical1的一個(gè)環(huán)與間隔鏈接觸，兩個(gè)帶正電的殘基K243和K245在10-11位與間隔鏈相互作用(圖4b)。在target的3‘端，兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)裂縫，用于dsRNA結(jié)合(圖4a)。HEPN1的殘基K54、K57、R179、K180、R155和R156和HEPN2的殘基R681靠近RNA主干(圖4d) 。此外，Cas13bt3Act中完全拉伸的IDL1與位置11-20附近的spacer/target dsRNA相互作用(圖4c) 。殘基K188、R191、R204、D205和T193的主干位于spacer/target dsRNA的主槽附近(圖4c) 。
 

圖4. Cas13bt3與dsRNA的相互作用。Cas13bt3中的spacer/target dsRNA結(jié)合界面。dsRNA 從target RNA 5′-端到3′-端進(jìn)行編號(hào)。b,c. 放大的Helical1環(huán)結(jié)構(gòu)域作用視圖(b), IDL1 (c), HEPN

生化實(shí)驗(yàn)與cas13bt3誘導(dǎo)的RNA敲降實(shí)驗(yàn)均顯示，Cas13bt3對(duì)target RNA具有一定的錯(cuò)配耐受性。

4 Cas13bt3活化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及工程應(yīng)用
作者在活性位點(diǎn)周圍發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)帶正電荷的patch（patch1和patch2），其在長(zhǎng)鏈target RNA結(jié)合時(shí)經(jīng)歷了構(gòu)象轉(zhuǎn)變(圖5a, b)，可能與HEPN的激活有關(guān)。Patch1中K194E、R608E/K609E和K645E的突變幾乎消除了HEPN的切割(圖5c) 。Patch2的R719殘基突變可使活性降低94%(圖5c) ， K748E突變使切割率降低50%(圖5c) 。
 

圖5. Cas13bt3的底物結(jié)合面。a. Cas13bt3帶電電位面的兩種視圖。target RNA的可能路徑用綠色虛線表示。b. 核酸酶活性位點(diǎn)周圍的Patch1和Patch2的放大圖。c. WT和突變Cas13bt3在Patch1和Patch2上的旁支切割活性。

為了在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和RNA敲降，需要一個(gè)既能有效切割target RNA、又能保持最小非特異性切割的Cas13系統(tǒng)，以減少靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組損耗。為此，作者在IDL和帶正電的patch上測(cè)試了一系列突變，并進(jìn)行體外切割凝膠試驗(yàn)(補(bǔ)充圖9e-h，Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)拍攝)。結(jié)果表明，活性位點(diǎn)附近的帶正電荷的patch可能更有助于非特異性RNA結(jié)合，從而導(dǎo)致旁支切割。

隨機(jī)誘變篩選顯示，干擾帶正電patch附近的疏水相互作用可能會(huì)影響局部折疊和RNA結(jié)合。作者在K645附近找到兩個(gè)疏水簇，分別在Y643和 Y647附近(圖6a) 。突變后的Y643A幾乎消除了這兩種切割活性，而Y647A顯著降低旁支切割活性至4%（Y647A蛋白濃度高達(dá)800nM時(shí)為10%）（圖6c），但仍保持70%的靶標(biāo)切割活性 (圖6b，補(bǔ)充圖9e, f)。也同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了Patch 1對(duì)Cas13bt3激活的關(guān)鍵作用。

最后，為評(píng)估結(jié)構(gòu)突變體(Y643A或Y647A)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的collateral effect，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)(圖6e, f)，合理設(shè)計(jì)的Cas13bt3 Y647A具有最小的collateral effect，同時(shí)保持強(qiáng)大的靶標(biāo)切割活性，是一種有前途的體內(nèi)RNA編輯工具和進(jìn)一步的治療應(yīng)用。
 

圖6. Cas13bt3的高保真切割工程。a. 殘基K645周圍的兩個(gè)疏水簇。b. 突變Cas13bt3歸一化的靶切和旁支切割活性。c. 不同蛋白濃度下WTCas13bt3、Y643A、Y647A旁支切割的代表性凝膠圖。d. 切割活性歸一化，如(c)所示。e. HEK293T細(xì)胞中Cas13bt3突變體的靶切及旁支切割。f. e中Cas13bt3突變體相對(duì)切割效率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。歸一化MFI為相對(duì)于dCas13bt3條件的平均熒光強(qiáng)度。

總之，作者通過對(duì)Cas13bt3的結(jié)構(gòu)和生化表征研究，揭示了其獨(dú)特的靶RNA識(shí)別和激活機(jī)制，或有助于指導(dǎo)最近發(fā)現(xiàn)的大量結(jié)構(gòu)域相似的新Cas13的研究。作者成功構(gòu)建了工程化變體，對(duì)指導(dǎo)Cas13bt3的體內(nèi)應(yīng)用具有重要意義。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41501-5