電穿孔是用于轉(zhuǎn)移非病毒載體以及將其他分子（DNA、藥物、RNA 或蛋白質(zhì)）引入靶細胞的技術(shù)之一。這種方法通過對細胞施加短持續(xù)時間和高電壓的電場，當電脈沖超過膜電容時，其穩(wěn)定性會受到影響并形成瞬時的可逆孔隙，分子可以通過這些孔隙進入細胞。利用電穿孔技術(shù)進行對細胞或活體的電轉(zhuǎn)染是一種現(xiàn)今常用的將DNA、siRNA 等分子輸送到細胞中的簡單有效的方法。利用電穿孔進行的轉(zhuǎn)染對比其他方法，不僅操作簡單快速、無需添加專用試劑、適用性廣，而且其轉(zhuǎn)染率高、無需考慮安全因素，在瞬時完成轉(zhuǎn)染過程的同時達到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的。

每種細胞類型需要的電轉(zhuǎn)條件略有不同，需要更優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果必須通過實驗確定電轉(zhuǎn)條件。有的細胞如原代細胞、免疫細胞、干細胞等會出現(xiàn)較難轉(zhuǎn)染的情況。而對于難轉(zhuǎn)染懸浮細胞，電穿孔是唯一成功用于將各種分子高效轉(zhuǎn)移到非貼壁細胞系中的技術(shù)。由于大多數(shù)轉(zhuǎn)染方法對非貼壁細胞難以進行，所以對靶基因的電轉(zhuǎn)成為將目的基因引入懸浮細胞的常見策略。在電轉(zhuǎn)難轉(zhuǎn)染細胞前，通過預(yù)實驗快速有效的優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件，可以高效且一致地將核酸遞送到細胞中，同時保持細胞活力。

 

《Systemic Optimization of Gene Electrotransfer Protocol Using Hard-to-Transfect UT-7 Cell Line as a Model》是立陶宛健康科學大學腫瘤研究所腫瘤研究實驗室在2022年11月發(fā)表于Biomedicines的文章。該實驗以UT-7這種轉(zhuǎn)染效率很低的懸浮細胞為例，討論對于難轉(zhuǎn)染的細胞系進行電轉(zhuǎn)染實驗方案的條件優(yōu)化，以平衡盡可能高的轉(zhuǎn)染效率與電轉(zhuǎn)后的細胞活力和細胞生長狀態(tài)。其中關(guān)于電轉(zhuǎn)染過程的系統(tǒng)優(yōu)化可以為我們在電轉(zhuǎn)染實驗中探索難轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染條件提供參考方法與改進方向。

實驗對UT-7 細胞系進行質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)，將編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP用作評估轉(zhuǎn)染效率的指標。通過進行不同的電穿孔參數(shù)的多組實驗，包括電脈沖方案的配置（振幅、持續(xù)時間、電壓和脈沖數(shù)）、DNase抑制劑、DNA/RNA濃度等，系統(tǒng)分析實驗結(jié)果，以實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染率且高細胞活性的電轉(zhuǎn)移。

結(jié)果分析

評估電轉(zhuǎn)染結(jié)果的方法

01

在不同脈沖強度和持續(xù)時間條件下 pEGFP 基因電轉(zhuǎn)后 UT-7 細胞的活力，通過流式細胞術(shù)計數(shù)、MTS 測定和 PI 染色進行評估。

實驗建立了一種門控策略，用于正確評估與 PI 共染色的轉(zhuǎn)染細胞，以區(qū)分樣品中四種不同的細胞亞群：轉(zhuǎn)染/活 (pEGFP+/PI-)、 未轉(zhuǎn)染/活 (pEGFP-/PI-)、 轉(zhuǎn)染/死亡 (pEGFP + /PI+) 和未轉(zhuǎn)染/死亡 (pEGFP-/PI+)。門控策略首先通過根據(jù)前向散射面積 (FSC-A) 與前向散射高度 (FSC-H) 的光學特性繪制細胞的流式散點圖，如圖1A。然后從未轉(zhuǎn)染的細胞(GFP-)中分離轉(zhuǎn)染細胞 (GFP+)，如圖1B。從死細胞 (PI+)中分離活細胞 (PI-)，如圖1C。由于無補償情況下GFP熒光會溢出到PI通道，如圖1E。所以在GFP通道中使用了6%的補償，如圖1F。

通過流式細胞術(shù)計數(shù)、MTS 測定和 PI 染色以區(qū)分活細胞和死細胞，從而對轉(zhuǎn)染后的細胞活率進行評估，利用三種不同的測定法來確定 UT-7 細胞的活力。因為無法在不丟失活細胞的情況下從樣品中洗掉死懸浮細胞，所以使用碘化丙啶 (PI) 來染色，然后通過流式細胞術(shù)對樣品中的所有細胞進行計數(shù)來獲得總細胞數(shù)，并將 PI 陽性（死）細胞排除在外。同時實驗嘗試了不同的電轉(zhuǎn)參數(shù)，并將PI染色 結(jié)果、MTS 測定結(jié)果與總細胞數(shù)進行了比較，如圖2。

根據(jù)圖2統(tǒng)計結(jié)果，細胞死亡率隨著電脈沖電壓和持續(xù)時間的增加而增加。代表細胞代謝活動的 MTS 結(jié)果僅在 1.4 kV/cm 250 µs 至 1.4 kV/cm 500 µs 不包括 1.2 kV/cm 500 µs 的電轉(zhuǎn)后明顯更高。且與 PI 陰性（活細胞）量相比，僅在1.4 kV/cm 500 µs使用 MTS 測定法確定的細胞活力顯著更高。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可見PI 染色和代謝活動顯示出相似的結(jié)果，相比而言使用 PI 染色可以同時測量細胞活力和轉(zhuǎn)染效率，所以對于本實驗PI 方法被優(yōu)于 MTS 方法，在本實驗中以PI染色結(jié)果作為細胞活性的判斷標準。

 

不同電場強度與脈沖時間的條件下評估細胞活力與轉(zhuǎn)染效率

02

根據(jù)轉(zhuǎn)染效率與細胞活率，通過實驗數(shù)據(jù)分析不同脈沖強度和持續(xù)時間對轉(zhuǎn)染結(jié)果的影響趨勢。實驗測試了不同的電穿孔條件，包括電場強度（1.2、1.4、1.6、1.8 kV/cm）和脈沖持續(xù)時間（100、250、500、750 μs）的變化。在每個實驗中，施加單個高壓脈沖，并使用 20 μg/mL 的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖3。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細胞可分為四個亞群，轉(zhuǎn)染/活細胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細胞數(shù)，如圖3A。轉(zhuǎn)染/活細胞亞群中的pEGFP平均熒光強度如圖3B。

圖3A的數(shù)據(jù)表明，增加脈沖強度和持續(xù)時間是轉(zhuǎn)染/死亡細胞數(shù)量增加的重要原因，由于一些細胞被成功轉(zhuǎn)染并且可以產(chǎn)生足夠被檢測到的EGFP蛋白但已經(jīng)死亡。此外，增加脈沖持續(xù)時間與轉(zhuǎn)染/活細胞比例增加直接相關(guān)。相比之下，脈沖強度對轉(zhuǎn)染/活細胞比例的作用不那么明顯。同時，死細胞亞群的細胞數(shù)量也是隨脈沖持續(xù)時間而非脈沖強度增加。對于未轉(zhuǎn)染/存活的亞群細胞數(shù)量和總細胞數(shù)量而言，都是隨著脈沖強度和持續(xù)時間的增加而顯著減少。該數(shù)據(jù)表現(xiàn)了了電轉(zhuǎn)參數(shù)選擇的復(fù)雜性。

與此同時，通過圖3B可知，轉(zhuǎn)染/活細胞亞群中平均熒光強度比轉(zhuǎn)染/活細胞數(shù)的增加更明顯，結(jié)果表明增加脈沖強度和持續(xù)時間有助于更多質(zhì)粒分子進入細胞。

 

DNase抑制劑對電穿孔過程的影響

03

使用DNase抑制劑ZnSO4，在之前證明轉(zhuǎn)染效率最高的實驗條件下評估ZnSO4對轉(zhuǎn)染效率GET的影響。用 1.4 kV/cm 250 µs、1.6 kV/cm 250 µs、1.8 kV/cm 250 µs、1.2 kV/cm 500 µs、1.4 kV/cm 500 µs 和 1.2 kV/cm 750 對UT-7 細胞進行電穿孔，之后分別加入80 µM和100 µM ZnSO4孵育48小時后分析轉(zhuǎn)染結(jié)果，如圖4。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細胞可分為四個亞群，轉(zhuǎn)染/活細胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細胞數(shù)，如圖4A。轉(zhuǎn)染/活細胞亞群中的pEGFP平均熒光強度如圖4B。

ZnSO4充當細胞內(nèi)核酸酶的抑制劑，可以在質(zhì)粒 DNA 進入細胞后防止質(zhì)粒降解。然而，通過數(shù)據(jù)可知ZnSO4對UT-7 細胞的 pEGFP 轉(zhuǎn)染效率沒有作用。如圖 4A所示，同一的電轉(zhuǎn)參數(shù)和不同的ZnSO4濃度，轉(zhuǎn)染/活細胞的亞群數(shù)量保持不變。且如圖 4B所示，對于不同的ZnSO4濃度時，平均熒光強度沒有顯著變化。通過實驗數(shù)據(jù)分析得知，DNase抑制劑ZnSO4并未對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生影響。

 

質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響

04

為探索在電轉(zhuǎn)溶液中質(zhì)粒pEGFP濃度對 UT-7 細胞轉(zhuǎn)染效率的影響，測試了多種質(zhì)粒濃度，包括20µg/mL、50µg/mL、100µg/mL 和 200 µg/mL。使用電壓強度為1.2kV/cm和1.4kV/cm，持續(xù)時間為 250 µs 的單個高壓脈沖。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率與細胞活率，通過實驗數(shù)據(jù)分析不同質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)染效率與細胞活性的影響趨勢。轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖5。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細胞可分為四個亞群，轉(zhuǎn)染/活細胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細胞數(shù)，如圖5A。轉(zhuǎn)染/活細胞亞群中的pEGFP平均熒光強度如圖5B。

根據(jù)統(tǒng)計學分析可知pEGFP 質(zhì)粒濃度是提高 UT-7 細胞轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，將 pEGFP 質(zhì)粒從 20 µM 增加到 200 µM 對細胞活力的影響很小，因此較高濃度質(zhì)粒的使用可以獲得更多轉(zhuǎn)染/存活的細胞。

 

結(jié)論

本實驗對電轉(zhuǎn)pEGFP 質(zhì)粒 DNA 到懸浮 UT-7 細胞系的方案進行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UT-7 細胞的轉(zhuǎn)染細胞率和細胞活力依賴于所選的方波脈沖持續(xù)時間，并且關(guān)鍵依賴于使用的質(zhì)粒 DNA 濃度，如圖6所示。

實驗分析可知，提高基因電轉(zhuǎn)到UT-7 細胞中效率的是電脈沖持續(xù)時間而不是電壓強度。但是脈沖強度和持續(xù)時間的增加大大降低了細胞活力，且轉(zhuǎn)染/活細胞數(shù)量沒有顯著增加。另一方面，質(zhì)粒濃度的增加大大提高了轉(zhuǎn)染效率，對細胞活力影響輕微。

在本次電轉(zhuǎn)優(yōu)化過程中可以得到結(jié)論：1、與脈沖強度相比，高壓脈沖持續(xù)時間的增加可以更有效的將基因電轉(zhuǎn)到UT-7 細胞中；2、一味地增加高壓脈沖強度和持續(xù)時間會導致更高的細胞傷害，而轉(zhuǎn)染/活細胞數(shù)量并不會增加；3、與脈沖持續(xù)時間和強度相比，pDNA 濃度的增加對轉(zhuǎn)染/活細胞亞群增加的影響更為顯著；4、DNAase 抑制劑 ZnSO4 對 pDNA 電轉(zhuǎn)到UT-7 細胞沒有影響，也不影響細胞活力。

討論

1.對于難轉(zhuǎn)染的細胞，進行不同電轉(zhuǎn)參數(shù)下電轉(zhuǎn)結(jié)果的測定方法與統(tǒng)計方法，有利于對電轉(zhuǎn)細胞條件的討論，推薦使用pDNA熒光與PI結(jié)果分析細胞活率和轉(zhuǎn)染效率�？啥嘟M進行預(yù)實驗，對電轉(zhuǎn)條件進行優(yōu)化。對于難轉(zhuǎn)染細胞不推薦使用程序型的電轉(zhuǎn)染或核轉(zhuǎn)染設(shè)備，由于其具體電脈沖參數(shù)用戶無法得知且不允許用戶控制電轉(zhuǎn)染參數(shù)，客戶無法根據(jù)需要對電穿孔過程的具體參數(shù)進行調(diào)整達到最優(yōu)電轉(zhuǎn)效果。

2.對于難轉(zhuǎn)細胞優(yōu)化電轉(zhuǎn)效率的方向，首先考慮提高質(zhì)粒的濃度，其次考慮適當增加高壓脈沖的持續(xù)時間和電壓強度，根據(jù)細胞轉(zhuǎn)染實際情況調(diào)整電轉(zhuǎn)條件。

 

 

產(chǎn)品介紹
日本BEX公司新款CUY21EDITIl電轉(zhuǎn)化儀，采用先進的脈沖技術(shù)，是一款無需專用試劑的全功能多模式活體細胞轉(zhuǎn)染儀器，目前已廣泛應(yīng)用于全球?qū)嶒炇�。CUY21可應(yīng)用于細胞的高效轉(zhuǎn)染，尤其適合于原代細胞、免疫細胞、干細胞等難轉(zhuǎn)染細胞的高轉(zhuǎn)化率和高存活率轉(zhuǎn)化。同時CUY21還可應(yīng)用于貼壁細胞、離體受精卵及活體的基因轉(zhuǎn)染，根據(jù)不同實驗需求選擇相應(yīng)電極進行體內(nèi)體外的轉(zhuǎn)染。

 

參考文獻

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