FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）樣本，即福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本。它承載了眾多疾病的關(guān)鍵信息，又可長(zhǎng)期室溫保存，所以是病理科當(dāng)之無(wú)愧的“瑰寶”。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品存儲(chǔ)在醫(yī)院或生物樣本庫(kù)中，其中絕大多數(shù)是FFPE樣本。

但是，F(xiàn)FPE樣本也因?yàn)楦�爾馬林的固定容易使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解和分子間的交聯(lián)，石蠟的高溫滲入過(guò)程進(jìn)一步加速核酸的降解，保存的時(shí)間及環(huán)境對(duì)樣品中的核酸也有巨大的影響。

因此，從FFPE樣本中提取出高質(zhì)量核酸，并構(gòu)建出信息完整、無(wú)偏好、可用于后續(xù)各類組學(xué)研究的文庫(kù)，則是“大大”的難題。

目前，針對(duì)FFPE樣本，10x Genomics已有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組解決方案，了解這些前沿技術(shù)，助力您全方位解鎖FFPE樣本中蘊(yùn)含的寶貴信息。

 圖1  FFPE樣本可用的前沿技術(shù)

一  FFPE樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

針對(duì) FFPE切片，使用二甲苯脫蠟；使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來(lái)消化組織，制備單細(xì)胞懸浮液，進(jìn)而抽核得到細(xì)胞核樣本；建庫(kù)時(shí)采用靶向基因的探針對(duì)雜交目標(biāo)RNA分子后連接的原理，進(jìn)而完成文庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程；該方法可以用來(lái)分析數(shù)千個(gè)至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核的基因表達(dá)，可檢測(cè)出人類或小鼠全轉(zhuǎn)錄組，尤其是低表達(dá)量的基因。

1.2 實(shí)驗(yàn)所需10x設(shè)備-Chromium X

Chromium X相當(dāng)靈活，適合任何實(shí)驗(yàn)室，能夠在單次運(yùn)行中分析數(shù)百至數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，讓百萬(wàn)級(jí)的細(xì)胞研究變得常規(guī)。

FFPE單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組油包水制備過(guò)程是在Chromium X設(shè)備當(dāng)中進(jìn)行的，運(yùn)行時(shí)間僅需5.5min，運(yùn)行溫度要求18-28℃，運(yùn)行濕度要求30-80%相對(duì)濕度。

圖2   油包水生成示意圖

圖3   油包水制備過(guò)程儀器界面圖

1.3 技術(shù)流程圖

1.4 樣本要求：

由于受蠟塊年齡、組織類型、固定前組織質(zhì)量、組織密度、組織面積以及其它因素的影響，致使相同面積和厚度的組織解離后獲取的細(xì)胞數(shù)量也存在較大差異。

對(duì)于人和小鼠的組織切片要求詳細(xì)如下：

人組織：建議每張切片厚度 25um，每 2 張切片放入 1 個(gè) 1.5mL 無(wú)核酸酶離心管中，建議多準(zhǔn)備 1-2 管備用。

小鼠組織：建議每張切片厚度 50um，每 2 張切片放入 1 個(gè) 1.5mL 無(wú)核酸酶離心管中，建議多準(zhǔn)備1-2 管備用。

FFPE組織質(zhì)量要求DV200>30%。

以下列出了 10x Genomics 公司已測(cè)試的 FFPE 組織切片，以及解離后單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞產(chǎn)量。參考該測(cè)試數(shù)據(jù)，可以估計(jì)特定組織類型/切片的近似細(xì)胞產(chǎn)量。


 

二 Visium CytAssist空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2.1 帶您認(rèn)識(shí)Visium CytAssist

全新的Visium CytAssist是一款小巧的臺(tái)式儀器。能夠?qū)⑥D(zhuǎn)錄組分析物從標(biāo)準(zhǔn)的載玻片轉(zhuǎn)移到Visium玻片上，便于您從更多種類的樣本中獲得空間分析的見(jiàn)解。CytAssist儀器與蘇木精-伊紅（H&E）染色或免疫熒光（IF）染色的FFPE組織切片兼容，讓預(yù)先以切片形式保存的組織也能用于Visium工作流程。您可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)技術(shù)篩選組織切片，找到有生物學(xué)意義的切片，然后用CytAssist儀器將這些切片與Visium玻片的捕獲區(qū)域精確對(duì)齊，從而最大限度發(fā)揮Visium實(shí)驗(yàn)的作用。

圖5 Visium CytAssist - 空間組學(xué)組織分析物轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

2.2 技術(shù)流程圖

圖6   基于Visium CytAssist的FFPE空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程圖

2.3 樣本要求：

2.3.1 樣本類型

①常規(guī)HE染色的FFPE切片

②FFPE組織蠟塊

2.3.2 RNA質(zhì)量

提取FFPE切片中總RNA，質(zhì)檢DV200，要求DV200>30%。

2.3.3 組織大小

根據(jù)要研究的組織區(qū)域大小，提供6.5mm x 6.5mm或11mm x 11mm兩種空間轉(zhuǎn)錄組玻片供選擇。

2.4 載玻片要求：

標(biāo)準(zhǔn)載玻片規(guī)格為25 x 75mm，由于不同廠家規(guī)格存在差異，可用于 Visium CytAssist平臺(tái)的載玻片最小規(guī)格為24.8 x 74.4mm，最大規(guī)格為25.3 x 76.2mm。

圖7  可用于Visium CytAssist 的4種載玻片

 

2.5 貼片要求：

組織需張貼在不同規(guī)格載玻片中的綠色框內(nèi)（上圖），超出綠色框的組織將無(wú)法在后續(xù)Visium CytAssist平臺(tái)轉(zhuǎn)片時(shí)被捕獲到。