综合图区亚洲网友自拍|亚洲黄色网络|成人无码网WWW在线观看,日本高清视频色视频kk266,激情综合五月天,欧美一区日韩一区中文字幕页

English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
當(dāng)前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > Celigo技術(shù)在基因治療和病毒研究中的應(yīng)用

Celigo技術(shù)在基因治療和病毒研究中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):3263 發(fā)布日期:2020-9-25  來源:Nexcelom
Biogen于1978年由幾位著名的生物學(xué)家,包括愛丁堡大學(xué)的Kenneth Murray、麻省理工學(xué)院的Phillip Allen Sharp,以及哈佛大學(xué)的Walter Gilbert和Charles Weissmann在日內(nèi)瓦成立。后來,Walter Gilbert和Phillip Allen Sharp先后榮獲諾貝爾化學(xué)獎和生理醫(yī)學(xué)獎。

雖然在這次COVID-19疫情期間Biogen公司以另一種方式被人們熟知,但依然不影響其作為神經(jīng)科學(xué)的先驅(qū)者在基因治療領(lǐng)域的重要地位。

本文重點介紹并全文翻譯了Biogen公司的生物檢測和基因治療團(tuán)隊于2019年發(fā)表于Molecular Therapy: Methods & Clinical Development的研究論文。研究者們?yōu)榱颂岣呷粘2《镜味葯z測中蝕斑實驗的速度、通量、靈敏度以及穩(wěn)定性,將熒光檢測方法與自動圖像計數(shù)相結(jié)合,并予以優(yōu)化。文章以通俗清晰的筆觸描述了研究團(tuán)隊開發(fā)和評估這一革新方法的全過程,并借此向廣大病毒學(xué)、基因治療和疫苗開發(fā)領(lǐng)域的相關(guān)工作者推薦。


綜合熒光檢測和基于圖像的自動計數(shù)方法提高蝕斑實驗的速度,靈敏度和可靠性
 


Abstract

蝕斑實驗(plaque assays)用于測定病毒樣品的感染滴度。這些實驗通常需要很多天來完成且通量較低。同時,肉眼識別和手工計數(shù)蝕斑非常耗時和費力,并且結(jié)果很可能還會受人為偏見和主觀判斷的影響導(dǎo)致分析人員之間的差異。同時,該實驗必須為期數(shù)天,使蝕斑增長到足夠大的尺寸以便適合于人工鑒定。這里,為了提高蝕斑實驗的靈敏度和速度,我們整合了熒光檢測和自動蝕斑計數(shù)的方法。首先,我們用熒光標(biāo)記的抗體對蝕斑進(jìn)行染色;其次,我們采用了一種基于多孔板的細(xì)胞圖像分析儀,從而實現(xiàn)了無偏見、非主觀的自動蝕斑計數(shù)。這兩種技術(shù)的整合使得實驗時長縮短了40% (從原來的5天減少到了3天),這是因為蝕斑的大小、信噪比和肉眼可見度已不再是制約因素。這種優(yōu)化了的蝕斑測定方法更加靈敏,快速、穩(wěn)定,同時也更加拓展了測定蝕斑形成的應(yīng)用和通量。

關(guān)鍵詞:蝕斑實驗,自動計數(shù),熒光檢測,測定可靠性,基于圖像的計數(shù),基因治療



Introduction

基因治療是一個在研究和臨床試驗中提供治療性基因的良好平臺。腺相關(guān)病毒(AAV)基于其有效性和良好的安全性,是將這些治療性基因?qū)胫涟屑?xì)胞的一種極有力的載體。AAV是一種非囊膜病毒,包括一條被蛋白質(zhì)外殼包裹的基因組單鏈DNA(ssDNA)。AAV可以通過多種方法生產(chǎn),包括瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎(HEK)細(xì)胞,使用哺乳動物工程細(xì)胞株、桿狀病毒感染的昆蟲SF9細(xì)胞,或諸如單純皰疹病毒(HSV)等輔助病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞株。因為重組AAV(rAAV)載體是有復(fù)制缺陷的,所以它們需要包含輔助功能的質(zhì)粒或輔助病毒(例如腺病毒或HSV)進(jìn)行復(fù)制。 在感染過程中,當(dāng)AAV進(jìn)入細(xì)胞核時,ssDNA變成雙鏈(ds)的形式。該dsDNA是基因表達(dá)所必需的。如果沒有輔助病毒,AAV會以潛伏形式保留在細(xì)胞中。但是,當(dāng)存在輔助病毒時,帶有目的基因的AAV就可被活化生產(chǎn)。由于最理想的rAAV的生產(chǎn)可以依賴于所用輔助病毒的濃度,因此輔助病毒的感染滴度是建立高效高產(chǎn)rAAV生產(chǎn)過程的關(guān)鍵因素之一。

腺病毒載體(adenovirus)不但是基因治療有力的工具,更是抗病毒疫苗開發(fā)的重要手段之一。腺病毒是一個正20面體形狀的病毒,將一段新冠病毒基因,如S抗原,傳遞進(jìn)入該病毒后,20面體上會出現(xiàn)類似新冠病毒的刺突。腺病毒本身毒力很弱,因此可以利用它把新冠病毒的刺突抗原帶入體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答。近日,軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所與天津康希諾生物股份公司聯(lián)合團(tuán)隊合作的重組新冠疫苗就是利用這一原理開發(fā)的,并于上周率先獲批臨床,在武漢市開展I期試驗。合作雙方作為Cellometer胞計數(shù)儀多年用戶,Nexcelom公司深感使命光榮。小編獲悉,研究團(tuán)隊已于武漢前方抗疫奮戰(zhàn)近兩個月,Cellometer胞計數(shù)儀也正用于疫苗臨床評價中的細(xì)胞免疫檢測環(huán)節(jié)。

有許多方法可以測定病毒基因組和感染顆粒的數(shù)量。病毒基因組滴度可通過RT-PCR,qPCR和Western blot等技術(shù)對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行實驗性測定而獲得;也可以利用衣殼蛋白滴度ELISA,流式細(xì)胞儀或市售病毒計數(shù)器對完整的病毒顆粒進(jìn)行定量。最后,如HSV病毒,可以使用功能實驗方法對病毒進(jìn)行定量,例如常規(guī)的蝕斑實驗(plaque assay)或細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)實驗。盡管蛋白質(zhì)和顆粒計數(shù)器的檢測快速且定量,但它們無法提供有關(guān)病毒的傳染性或功能性的信息。 

病毒滴度檢測是病毒學(xué)研究中最重要的步驟之一。病毒的滴度用來表示樣本中病毒的含量。病毒滴度的高低與活躍病毒的感染力(infectivity)強(qiáng)弱相關(guān),因此也被用作臨床病毒感染中的治療監(jiān)測。實驗中的病毒滴度通常測定病毒顆粒在特定細(xì)胞類型或動物中復(fù)制的能力。常用的檢測方式有蝕斑實驗(plaque assay)、灶斑形成實驗(focus formation assay)和終點稀釋實驗(endpoint dilution assay)等。

細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)常被應(yīng)用于鏡下可觀察到的病毒介導(dǎo)的(單層)細(xì)胞惡性變化。這些細(xì)胞形態(tài)改變包括細(xì)胞膨脹或收縮,細(xì)胞變圓、分散、聚團(tuán)、裂解等,以及合胞體(syncytia)或胞內(nèi)內(nèi)涵物(inclusions)的形成。病毒感染導(dǎo)致的單層貼壁細(xì)胞裂解消失是最常見的CPE類型。若局部細(xì)胞可裂解形成肉眼可見的不連續(xù)的“空洞”,即為蝕斑。根據(jù)病毒類型的不同形成人眼可見的蝕斑通常需要3-14天。同時,宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基的類型和pH都會影響形成蝕斑的大小和數(shù)量。

蝕斑實驗流程示例見下圖:





經(jīng)典的病毒感染滴度就是通過蝕斑實驗來測定的。通常,將細(xì)胞接種在多孔培養(yǎng)板中形成匯合的單細(xì)胞層。在第二天,將細(xì)胞用稀釋的病毒樣品接種一段特定的時間(時間取決于滴定的輔助病毒)。除去接種物并用新鮮培養(yǎng)基換液,再將細(xì)胞孵育若干天,直到形成大到足以通過肉眼觀察和計數(shù)的蝕斑。傳統(tǒng)的蝕斑測定需要花費數(shù)天的時間,勞動強(qiáng)度大,并且由于不同分析人員對蝕斑進(jìn)行手工計數(shù),因此結(jié)果會比較主觀。

在這里,我們將Nexcelom公司的Celigo成像分析系統(tǒng)應(yīng)用到傳統(tǒng)蝕斑實驗的工作流程中,從而自動成像、識別并計數(shù)蝕斑個數(shù)。自動化蝕斑計數(shù)不僅與手動蝕斑計數(shù)結(jié)果相一致,而且還通過消除人為偏見提高了測定的可靠性。同時,我們還整合了斑塊的熒光檢測,由于熒光可以更早地檢測出通常肉眼看不到的微小斑塊,因此不但提高了檢測靈敏度還縮短了檢測時長。應(yīng)用該方法可以明顯地增加實驗和分析的通量,以加速關(guān)鍵的工藝開發(fā)流程。

Results-手動計數(shù)對比自動計數(shù)

蝕斑實驗開發(fā)于上個世紀(jì)50年代,一直被認(rèn)為是定量測定病毒滴度的金標(biāo)準(zhǔn)。可令人驚訝的是,通過分析人員可視化識別和手工計數(shù)蝕斑的方法至今仍然被廣泛使用。 這種計數(shù)方法顯然會受制于分析員之間的差異。

我們對Nexcelom的Celigo成像分析系統(tǒng)能否成像并準(zhǔn)確地計數(shù)輔助病毒蝕斑的能力進(jìn)行了評估,將傳統(tǒng)的肉眼計數(shù)法與自動成像計數(shù)法進(jìn)行了比較,總結(jié)如圖1。Celigo通過已建好的參數(shù)設(shè)置自動檢測并計數(shù)每個孔中的蝕斑,并高亮顯示每一個斑塊,以及每孔的總斑塊數(shù)。 圖2A展示了在Celigo上成像的24孔板,每個孔的蝕斑總數(shù)顯示在每孔的底部。 此外,還能顯示每個單孔的圖像,蝕斑的位置被軟件填充為綠色,以便于觀察。



圖2B中的結(jié)果表明,Celigo成像分析系統(tǒng)的計數(shù)結(jié)果與多個分析人員的傳統(tǒng)計數(shù)結(jié)果相似。手動計數(shù)和自動計數(shù)之間的平均標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為3,平均相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為4%。 兩種蝕斑計數(shù)方法之間也存在很強(qiáng)的線性相關(guān)性,R2 = 0.9791。 不同日期測定的對照樣品的數(shù)據(jù)平均差異為5.3%,表明了相同樣品在不同實驗日期和不同檢測批次間的結(jié)果相一致。 這些結(jié)果表明,由Celigo成像分析系統(tǒng)進(jìn)行的自動蝕斑計數(shù)與傳統(tǒng)的計數(shù)方法具備可比性,同時也突顯出消除分析員之間的偏見和主觀性判斷等弊端的潛力。通過對傳統(tǒng)蝕斑實驗的簡化處理,大大地提高了實驗的通量和可靠性。

Results-利用熒光檢測的自動蝕斑計數(shù)

HSV病毒蝕斑實驗一般需要耗時5天來測定。該實驗的工作流程如圖1所示。該實驗的瓶頸就是蝕斑的手工計數(shù)步驟。這種計數(shù)方法要求蝕斑要形成足夠大,以致到肉眼可見的程度。在該方法中,通過偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的病毒抗體,以及四氯化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色,使得蝕斑可視化,(以此作為參照)我們測試了使用熒光標(biāo)記抗體的熒光成像是否可以作為該實驗的另一種改進(jìn)方法。如圖3A所示,用熒光標(biāo)記的抗體染色同樣可以在感染3天后看到(與基于HRP抗體染色的方法)相似的蝕斑,并且同樣可以通過Celigo分析儀成像并自動計數(shù)蝕斑。更重要的是,兩種方法在感染后第3天都檢測到相似的蝕斑數(shù)量(如圖3B)。


使用熒光檢測的益處是它能夠消除蝕斑必須生長足夠大到能用肉眼看清這一瓶頸。用傳統(tǒng)的HRP標(biāo)記方法染色的蝕斑也只能在感染后3天才能被肉眼識別。由于Celigo成像分析儀可以識別并計數(shù)難以用肉眼看到的蝕斑,因而可以將傳統(tǒng)實驗縮短到感染后2天就可以讀數(shù)。盡管蝕斑的大小和形態(tài)在不同的天數(shù)時有所不同,但所有樣本在感染后的不同時期內(nèi)的蝕斑數(shù)量非常一致,如圖3B所示。這些結(jié)果證明,熒光檢測會形成與傳統(tǒng)方法數(shù)量相近的蝕斑,且保持一致的準(zhǔn)確度。將蝕斑的熒光檢測與自動計數(shù)相結(jié)合,可以顯著提高蝕斑實驗的速度,時間上從5天縮短到3天完成,如圖1所示。

Disucssion


這里所介紹的使用熒光檢測的自動蝕斑計數(shù)方法有助于加快蝕斑檢測的速度。但是,有幾種類型的感染性病毒滴度實驗不會形成蝕斑。半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)就是另一種常用的病毒滴定方法。TCID50是終點稀釋測定法,用于確定感染50%接種細(xì)胞所需的病毒樣品稀釋度。由于蝕斑和TCID50分析都是要歷時多天且通量較低,因此急需其他更快的方法。帶有GFP標(biāo)簽的腺病毒載體,可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測被感染的細(xì)胞,該方法通常需要大約一天的時間,樣品用流式方法和蝕斑實驗檢測具有相近的病毒滴度結(jié)果,這也使其成為蝕斑實驗頗具吸引力的替代方法。
 



已有報道稱使用陰離子交換柱的高效液相色譜(HPLC)方法可以定量桿狀病毒中的病毒顆粒。用SYBR綠色熒光染料標(biāo)記病毒的DNA后,可在25分鐘內(nèi)從陰離子交換柱上洗脫到病毒粒子。盡管該方法可以定量一個樣品中存在的病毒顆粒數(shù)量,但不一定檢測的是感染性病毒的數(shù)量。 此外,微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)還可以量化反應(yīng)中目標(biāo)DNA的絕對數(shù)量。

此處描述的自動蝕斑計數(shù)方法是傳統(tǒng)蝕斑實驗的一大進(jìn)步,對于不形成蝕斑感染的類“蝕斑”形成實驗也有所幫助。

例如,有種方法是用來確定腺病毒5(Ad5,一種輔助病毒)的感染性的,叫做灶斑形成實驗(focus formation assay)。 與蝕斑測定相似,用連續(xù)稀釋后的病毒樣品感染細(xì)胞,然后將細(xì)胞固定,與抗病毒的HRP偶聯(lián)抗體一起孵育,并用DAB底物顯色。用Ad5感染的細(xì)胞形成可計數(shù)的灶斑(Foci),結(jié)果以每毫升感染單元(ifu/mL)的形式表示。通過參數(shù)優(yōu)化,Celigo可用于識別和計數(shù)單個灶斑,從而有助于提高灶斑的讀檢速度。

已有研究報道,一個類似的的熒光灶形成實驗(fluorescent focus formation assay)可取代鼠諾如病毒(MNV)的蝕斑實驗。在該實驗中,MNV抗原帶有熒光標(biāo)簽,由于病毒抗原的表達(dá)早于蝕斑的形成,因此該方法可以比蝕斑實驗更快速地定量感染滴度。Celigo在該實驗中可用于自動計數(shù)灶斑形成單元(focus-forming units,F(xiàn)FU)。

最近也有不少研究,將將近紅外熒光與LI-COR Biosciences的胞內(nèi)Western blot系統(tǒng)相結(jié)合,也證明了相對于傳統(tǒng)蝕斑實驗,在檢測靈敏度和速度方面也有一定程度的提高。不過,與LI-COR系統(tǒng)不同的是,我們采用的Celigo成像分析儀除了熒光檢測外,還可以用于非熒光斑塊的成像識別。

電阻抗技術(shù)也曾被用來評估細(xì)胞的病毒感染。研究表明,阻抗技術(shù)可用于實時監(jiān)測病毒與細(xì)胞間的相互作用,并檢測某些抗病毒藥物的瞬時效用。但是,此技術(shù)的工作流程無法計算傳統(tǒng)蝕斑實驗中蝕斑形成單位(plaque-forming unit,PFU)的數(shù)值。


盡管有很多新方法用于感染性病毒滴度的定量測定,但蝕斑實驗和TCID50檢測仍是病毒滴定的金標(biāo)準(zhǔn)。這里描述的自動蝕斑計數(shù)方法是對傳統(tǒng)方法的完善和改進(jìn)。通過利用自動計數(shù)和計算機(jī)算法來計數(shù)蝕斑,消除了分析者的主觀因素。使用Celigo成像分析儀還可以大大減少蝕斑計數(shù)的時間并提高數(shù)據(jù)一致性。當(dāng)該技術(shù)應(yīng)用于48孔或96孔板時,還可以顯著地提高樣品通量,從而助益于工藝優(yōu)化環(huán)節(jié)中的大量樣品的分析。此外,通過整合蝕斑的熒光檢測,檢測時長可以減少40%,同時保持與傳統(tǒng)蝕斑實驗相同的計數(shù)性能。

使用基于計算機(jī)的成像系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是提高了數(shù)據(jù)的獲取、結(jié)果記錄以及可追溯性。
同時,存儲和回顧圖像的功能使得設(shè)置實驗驗收標(biāo)準(zhǔn)更加清晰,并在培訓(xùn)新的分析人員時提供指導(dǎo)和示范。在質(zhì)量控制或良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)環(huán)境中,每項實驗運行的過程都同時需要分析和審核人員。通過應(yīng)用具有自動蝕斑計數(shù)的板式成像分析儀,每一次分析結(jié)果和數(shù)據(jù)回顧的過程都能夠被完整地記錄,并且保存的原始細(xì)胞圖像以供監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行備案或?qū)徲嫛?/strong>

我們的目的是評估可以輕松應(yīng)用到當(dāng)前蝕斑實驗工作流程中的新技術(shù),自動生成PFU值,并提高實驗的可靠性,靈敏度和速度。這項研究強(qiáng)調(diào)了通過自動成像技術(shù)等簡單的解決方案對經(jīng)典檢測方法的改進(jìn)。



Nexcelom Bioscience時刻為廣大新冠病毒的研究和疫苗開發(fā)提供無償服務(wù)與幫助,共同面對全球疫情的挑戰(zhàn)。歡迎致電021-5886 0038。

祝新冠肺炎患者早日康復(fù),愿全世界疫情快點結(jié)束!Better tool for better biology for better life!

來源:耐細(xì)隆生物儀器(上海)有限公司
聯(lián)系電話:021-60645803
E-mail:chunhong.li@revvity.com

標(biāo)簽: 病毒 蝕斑 基因治療
用戶名: 密碼: 匿名 快速注冊 忘記密碼
評論只代表網(wǎng)友觀點,不代表本站觀點。 請輸入驗證碼: 8795
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com