蝕斑實驗流程示例見下圖:
經(jīng)典的病毒感染滴度就是通過蝕斑實驗來測定的。通常,將細(xì)胞接種在多孔培養(yǎng)板中形成匯合的單細(xì)胞層。在第二天,將細(xì)胞用稀釋的病毒樣品接種一段特定的時間(時間取決于滴定的輔助病毒)。除去接種物并用新鮮培養(yǎng)基換液,再將細(xì)胞孵育若干天,直到形成大到足以通過肉眼觀察和計數(shù)的蝕斑。傳統(tǒng)的蝕斑測定需要花費數(shù)天的時間,勞動強(qiáng)度大,并且由于不同分析人員對蝕斑進(jìn)行手工計數(shù),因此結(jié)果會比較主觀。
在這里,我們將Nexcelom公司的Celigo成像分析系統(tǒng)應(yīng)用到傳統(tǒng)蝕斑實驗的工作流程中,從而自動成像、識別并計數(shù)蝕斑個數(shù)。自動化蝕斑計數(shù)不僅與手動蝕斑計數(shù)結(jié)果相一致,而且還通過消除人為偏見提高了測定的可靠性。同時,我們還整合了斑塊的熒光檢測,由于熒光可以更早地檢測出通常肉眼看不到的微小斑塊,因此不但提高了檢測靈敏度還縮短了檢測時長。應(yīng)用該方法可以明顯地增加實驗和分析的通量,以加速關(guān)鍵的工藝開發(fā)流程。
Results-手動計數(shù)對比自動計數(shù)
蝕斑實驗開發(fā)于上個世紀(jì)50年代,一直被認(rèn)為是定量測定病毒滴度的金標(biāo)準(zhǔn)。可令人驚訝的是,通過分析人員可視化識別和手工計數(shù)蝕斑的方法至今仍然被廣泛使用。 這種計數(shù)方法顯然會受制于分析員之間的差異。
我們對Nexcelom的Celigo成像分析系統(tǒng)能否成像并準(zhǔn)確地計數(shù)輔助病毒蝕斑的能力進(jìn)行了評估,將傳統(tǒng)的肉眼計數(shù)法與自動成像計數(shù)法進(jìn)行了比較,總結(jié)如圖1。Celigo通過已建好的參數(shù)設(shè)置自動檢測并計數(shù)每個孔中的蝕斑,并高亮顯示每一個斑塊,以及每孔的總斑塊數(shù)。 圖2A展示了在Celigo上成像的24孔板,每個孔的蝕斑總數(shù)顯示在每孔的底部。 此外,還能顯示每個單孔的圖像,蝕斑的位置被軟件填充為綠色,以便于觀察。
圖2B中的結(jié)果表明,Celigo成像分析系統(tǒng)的計數(shù)結(jié)果與多個分析人員的傳統(tǒng)計數(shù)結(jié)果相似。手動計數(shù)和自動計數(shù)之間的平均標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為3,平均相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為4%。 兩種蝕斑計數(shù)方法之間也存在很強(qiáng)的線性相關(guān)性,R2 = 0.9791。 不同日期測定的對照樣品的數(shù)據(jù)平均差異為5.3%,表明了相同樣品在不同實驗日期和不同檢測批次間的結(jié)果相一致。 這些結(jié)果表明,由Celigo成像分析系統(tǒng)進(jìn)行的自動蝕斑計數(shù)與傳統(tǒng)的計數(shù)方法具備可比性,同時也突顯出消除分析員之間的偏見和主觀性判斷等弊端的潛力。通過對傳統(tǒng)蝕斑實驗的簡化處理,大大地提高了實驗的通量和可靠性。
Results-利用熒光檢測的自動蝕斑計數(shù)
HSV病毒蝕斑實驗一般需要耗時5天來測定。該實驗的工作流程如圖1所示。該實驗的瓶頸就是蝕斑的手工計數(shù)步驟。這種計數(shù)方法要求蝕斑要形成足夠大,以致到肉眼可見的程度。在該方法中,通過偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的病毒抗體,以及四氯化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色,使得蝕斑可視化,(以此作為參照)我們測試了使用熒光標(biāo)記抗體的熒光成像是否可以作為該實驗的另一種改進(jìn)方法。如圖3A所示,用熒光標(biāo)記的抗體染色同樣可以在感染3天后看到(與基于HRP抗體染色的方法)相似的蝕斑,并且同樣可以通過Celigo分析儀成像并自動計數(shù)蝕斑。更重要的是,兩種方法在感染后第3天都檢測到相似的蝕斑數(shù)量(如圖3B)。
使用熒光檢測的益處是它能夠消除蝕斑必須生長足夠大到能用肉眼看清這一瓶頸。用傳統(tǒng)的HRP標(biāo)記方法染色的蝕斑也只能在感染后3天才能被肉眼識別。由于Celigo成像分析儀可以識別并計數(shù)難以用肉眼看到的蝕斑,因而可以將傳統(tǒng)實驗縮短到感染后2天就可以讀數(shù)。盡管蝕斑的大小和形態(tài)在不同的天數(shù)時有所不同,但所有樣本在感染后的不同時期內(nèi)的蝕斑數(shù)量非常一致,如圖3B所示。這些結(jié)果證明,熒光檢測會形成與傳統(tǒng)方法數(shù)量相近的蝕斑,且保持一致的準(zhǔn)確度。將蝕斑的熒光檢測與自動計數(shù)相結(jié)合,可以顯著提高蝕斑實驗的速度,時間上從5天縮短到3天完成,如圖1所示。
Disucssion
這里所介紹的使用熒光檢測的自動蝕斑計數(shù)方法有助于加快蝕斑檢測的速度。但是,有幾種類型的感染性病毒滴度實驗不會形成蝕斑。半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)就是另一種常用的病毒滴定方法。TCID50是終點稀釋測定法,用于確定感染50%接種細(xì)胞所需的病毒樣品稀釋度。由于蝕斑和TCID50分析都是要歷時多天且通量較低,因此急需其他更快的方法。帶有GFP標(biāo)簽的腺病毒載體,可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測被感染的細(xì)胞,該方法通常需要大約一天的時間,樣品用流式方法和蝕斑實驗檢測具有相近的病毒滴度結(jié)果,這也使其成為蝕斑實驗頗具吸引力的替代方法。
已有報道稱使用陰離子交換柱的高效液相色譜(HPLC)方法可以定量桿狀病毒中的病毒顆粒。用SYBR綠色熒光染料標(biāo)記病毒的DNA后,可在25分鐘內(nèi)從陰離子交換柱上洗脫到病毒粒子。盡管該方法可以定量一個樣品中存在的病毒顆粒數(shù)量,但不一定檢測的是感染性病毒的數(shù)量。 此外,微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)還可以量化反應(yīng)中目標(biāo)DNA的絕對數(shù)量。
此處描述的自動蝕斑計數(shù)方法是傳統(tǒng)蝕斑實驗的一大進(jìn)步,對于不形成蝕斑感染的類“蝕斑”形成實驗也有所幫助。
例如,有種方法是用來確定腺病毒5(Ad5,一種輔助病毒)的感染性的,叫做灶斑形成實驗(focus formation assay)。 與蝕斑測定相似,用連續(xù)稀釋后的病毒樣品感染細(xì)胞,然后將細(xì)胞固定,與抗病毒的HRP偶聯(lián)抗體一起孵育,并用DAB底物顯色。用Ad5感染的細(xì)胞形成可計數(shù)的灶斑(Foci),結(jié)果以每毫升感染單元(ifu/mL)的形式表示。通過參數(shù)優(yōu)化,Celigo可用于識別和計數(shù)單個灶斑,從而有助于提高灶斑的讀檢速度。
已有研究報道,一個類似的的熒光灶形成實驗(fluorescent focus formation assay)可取代鼠諾如病毒(MNV)的蝕斑實驗。在該實驗中,MNV抗原帶有熒光標(biāo)簽,由于病毒抗原的表達(dá)早于蝕斑的形成,因此該方法可以比蝕斑實驗更快速地定量感染滴度。Celigo在該實驗中可用于自動計數(shù)灶斑形成單元(focus-forming units,F(xiàn)FU)。
最近也有不少研究,將將近紅外熒光與LI-COR Biosciences的胞內(nèi)Western blot系統(tǒng)相結(jié)合,也證明了相對于傳統(tǒng)蝕斑實驗,在檢測靈敏度和速度方面也有一定程度的提高。不過,與LI-COR系統(tǒng)不同的是,我們采用的Celigo成像分析儀除了熒光檢測外,還可以用于非熒光斑塊的成像識別。
電阻抗技術(shù)也曾被用來評估細(xì)胞的病毒感染。研究表明,阻抗技術(shù)可用于實時監(jiān)測病毒與細(xì)胞間的相互作用,并檢測某些抗病毒藥物的瞬時效用。但是,此技術(shù)的工作流程無法計算傳統(tǒng)蝕斑實驗中蝕斑形成單位(plaque-forming unit,PFU)的數(shù)值。
盡管有很多新方法用于感染性病毒滴度的定量測定,但蝕斑實驗和TCID50檢測仍是病毒滴定的金標(biāo)準(zhǔn)。這里描述的自動蝕斑計數(shù)方法是對傳統(tǒng)方法的完善和改進(jìn)。通過利用自動計數(shù)和計算機(jī)算法來計數(shù)蝕斑,消除了分析者的主觀因素。使用Celigo成像分析儀還可以大大減少蝕斑計數(shù)的時間并提高數(shù)據(jù)一致性。當(dāng)該技術(shù)應(yīng)用于48孔或96孔板時,還可以顯著地提高樣品通量,從而助益于工藝優(yōu)化環(huán)節(jié)中的大量樣品的分析。此外,通過整合蝕斑的熒光檢測,檢測時長可以減少40%,同時保持與傳統(tǒng)蝕斑實驗相同的計數(shù)性能。
使用基于計算機(jī)的成像系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是提高了數(shù)據(jù)的獲取、結(jié)果記錄以及可追溯性。同時,存儲和回顧圖像的功能使得設(shè)置實驗驗收標(biāo)準(zhǔn)更加清晰,并在培訓(xùn)新的分析人員時提供指導(dǎo)和示范。在質(zhì)量控制或良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)環(huán)境中,每項實驗運行的過程都同時需要分析和審核人員。通過應(yīng)用具有自動蝕斑計數(shù)的板式成像分析儀,每一次分析結(jié)果和數(shù)據(jù)回顧的過程都能夠被完整地記錄,并且保存的原始細(xì)胞圖像以供監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行備案或?qū)徲嫛?/strong>
我們的目的是評估可以輕松應(yīng)用到當(dāng)前蝕斑實驗工作流程中的新技術(shù),自動生成PFU值,并提高實驗的可靠性,靈敏度和速度。這項研究強(qiáng)調(diào)了通過自動成像技術(shù)等簡單的解決方案對經(jīng)典檢測方法的改進(jìn)。
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