（一） Alveole PRIMO 的原理

定制細(xì)胞模型， 研究微環(huán)境對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間機(jī)能的影響是細(xì)胞和醫(yī)學(xué)研究的重要方
向。 如何制備出具有可控性和重復(fù)性的微環(huán)境， 以便更有效的研究活細(xì)胞和疾病模型， 一直
以來都是生物學(xué)家進(jìn)行體外細(xì)胞研究所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。

法國 Alveole PRIMO “定制化細(xì)胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” 是創(chuàng)新性定制細(xì)胞模型的工具，
能在微米級別的尺度下， 以具有超高靈活度和再現(xiàn)性的生物工程手段實現(xiàn)體外微環(huán)境的定
制， 同時可對其機(jī)械力學(xué)和生化特性進(jìn)行設(shè)計微調(diào)。 圖 1. 左圖： 選擇電腦中任意一張圖案， 在 LEONARDO 軟件作用下， 用 PRIMO 進(jìn)行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數(shù)倒置顯微鏡兼容。 右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態(tài)， 控制投射在細(xì)胞
基質(zhì)上的紫外激光的照射強(qiáng)度、 照射時間和照射區(qū)域， 按照圖案進(jìn)行靈活蝕刻【1】 。
  圖 2. PRIMO 有三種設(shè)計方法： （1） 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） ： 適用于細(xì)胞
微環(huán)境研究； （2） 水凝膠的結(jié)構(gòu)化： 適用于 3D 細(xì)胞培養(yǎng)； （3） 微制造（Microfabrication）：適用于制造微流控芯片【1】 。
我們先探討第一種設(shè)計： 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） ， 可建立生物模型， 實現(xiàn)
體外微環(huán)境的定制， 同時對其機(jī)械力學(xué)和生化特性進(jìn)行設(shè)計微調(diào)。 圖 3. 第一種設(shè)計： 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） 。 先在基質(zhì)上包裹一層防污涂
層（ antifouling layer） ， 阻礙蛋白質(zhì)粘附。 PRIMO 利用非接觸式、 無掩模的光刻技術(shù)，
用 UV 光將圖案投射到細(xì)胞基質(zhì)上， 在 PLPP 光敏引發(fā)劑幫助下， 防污涂層被降解， 蝕刻出微
圖案， 蛋白可粘附在蝕刻出的微圖案上， 細(xì)胞粘附在蛋白上， 可適應(yīng)于基質(zhì)上定制的生物化
學(xué)、 表面形貌和硬度等特征， 形成定制的細(xì)胞模型。 適用于細(xì)胞微環(huán)境研究【1】 。

（二） PRIMO 的主要特點(diǎn)和優(yōu)勢【1】 ：

 無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強(qiáng)度、 照
射時間、 區(qū)域；
 自動化： 全自動快速定制， 可針對實驗條件進(jìn)行快速優(yōu)化；
 高靈活性： 可按照任意圖案去構(gòu)建您的基質(zhì)和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復(fù)雜
程度， 生成不同的細(xì)胞模型；
 多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)， 基質(zhì)可為平面或有微結(jié)構(gòu)， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養(yǎng)皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質(zhì)膠） 、 光刻膠， 等；
 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；
 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
 多種蛋白： 可應(yīng)用 3 種不同蛋白（根據(jù)實驗需求） ；
 自動對齊： 自動進(jìn)行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結(jié)構(gòu)或者微圖案上；
 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。

（ 三） 應(yīng)用舉例：

（ 1） 研究細(xì)胞間作用力 圖 4. 為檢測氣道平滑肌（ASM） 細(xì)胞是如何互相作用并與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 作用的， 用 PRIMO設(shè)計了一個長方形結(jié)構(gòu)， 將兩個細(xì)胞組合在一起【 2】 。 圖 A： 剛度為 E=300Pa 的基質(zhì)可用來模擬健康的人氣管的細(xì)胞外基質(zhì)（ ECM） ， 此時 ASM 細(xì)胞形成穩(wěn)定的細(xì)胞-細(xì)胞連接， 交界處清楚地顯示紅色的β -連環(huán)蛋白（ 細(xì)胞-細(xì)胞間粘附連接（ adherens junction)的標(biāo)志物，
紅色） 。 （ B-C） ： 重新建模的剛性更強(qiáng)的 ECM， E =13kPa-40kPa， 當(dāng) ECM 剛性增強(qiáng)到 13kPa時， 可以看出細(xì)胞交界處出現(xiàn)了綠色的黏著斑蛋白（ 細(xì)胞-ECM 間黏著斑連接(focal adhesion)的標(biāo)志物， 黃色箭頭） 。 當(dāng) ECM 剛性增強(qiáng)到 40kPa 時， 細(xì)胞交界處的β -連環(huán)蛋白（ 紅色）讓位給了黏著斑蛋白（ 綠色， 黃色箭頭） ， 說明平滑肌力從“細(xì)胞-細(xì)胞之間傳導(dǎo)” 變成了“通過 ECM 傳導(dǎo)” 。
PRIMO 作用： 在聚二甲基硅氧烷（ PDMS） 軟基質(zhì)上進(jìn)行 Micropatterning 設(shè)計， 粘附明膠和
ECM 蛋白， 再種上 ASM 細(xì)胞創(chuàng)建兩個平滑肌細(xì)胞的作用力模型， 通過牽引力顯微鏡研究基質(zhì)
的剛性如何影響平滑肌細(xì)胞間的力的傳導(dǎo)（ ECM 剛度是一個開關(guān)， 可以調(diào)控平滑肌力是“ 通
過 ECM” 傳導(dǎo)的， 還是“通過細(xì)胞-細(xì)胞之間的聯(lián)系” 傳導(dǎo)的） 。

（ 2） 觀察心肌細(xì)胞的收縮 圖 5. 左列圖： 心肌細(xì)胞在玻璃培養(yǎng)皿上的收縮； 中列圖： 沿著小箭頭方向收縮； 右列圖：
收縮力的顯示【3】 。

PRIMO 實驗： 在玻璃培養(yǎng)皿上， 先加上聚-L-賴氨酸接枝聚乙二醇（PLL-g-PEG） ， 再加 PLPP
光引發(fā)劑， 用 PRIMO 對 PLL-g-PEG 進(jìn)行蝕刻， 粘附上纖維連接蛋白（fibronectin） 和纖維
蛋白原（fibrinogen） ， 最后加上斑馬魚的心肌細(xì)胞， 進(jìn)行 STORM 成像。 哈佛醫(yī)學(xué)院的
Schaibble 等人觀察到?jīng)]有進(jìn)行 micropatterned 的細(xì)胞收縮不佳， 且以異步（不同時） 方
式進(jìn)行， 而 micropatterned 的細(xì)胞則表現(xiàn)出更高且更同步的收縮力。 值得注意的是， 他們
觀察到細(xì)胞強(qiáng)度收縮時的 L/ I 比值。 心肌細(xì)胞收縮的基本單位是肌原纖維節(jié)組
織（sarcomere） 。 Bray 等人在研究微圖像（micropatterns） 上的單個細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)， 肌原
纖維節(jié)在拉長的細(xì)胞內(nèi)排列更整齊。

PRIMO 作用： 將細(xì)胞組成不同的圖像： 四方形、 長條形， 等。 組成圖像的心肌細(xì)胞的力學(xué)輸
出增加， 微圖像促進(jìn)了協(xié)作的心肌細(xì)胞的收縮。

（3） 研究邊界條件對細(xì)胞遷移的影響


圖 6.研究細(xì)胞形態(tài)和遷移速度如何受到細(xì)胞側(cè)向限制的影響【4】 。
PRIMO 實驗： 用 Micropatterning 設(shè)計出 5 個連接的不同寬度的微通道， 通道寬度分別是：
5, 9, 13, 17 and 21 µm， 總長度是 320 µm， 細(xì)的部分連接到一個直徑 50 µm 的圓盤。 研
究細(xì)胞在微通道里的遷移過程。

PRIMO 作用： 用微通道對細(xì)胞進(jìn)行側(cè)向限制， 對細(xì)胞施加不同的限制力， 這種限制作用可調(diào)
節(jié)三維的細(xì)胞形態(tài)并影響細(xì)胞遷移速度。 用來模擬上皮組織中 follower cell 形成的空間
限制作用， PRIMO 可加速設(shè)計過程。

（4） 研究細(xì)胞的趨觸性 圖 7. 研究不同粘度的基質(zhì)誘導(dǎo) T 細(xì)胞的趨觸性： 在不同的粘附條件下， T 細(xì)胞在 ICAM-1
基質(zhì)上的運(yùn)動軌跡【5】 。

細(xì)胞趨觸性： 定向遷移是細(xì)胞運(yùn)動的關(guān)鍵形式， 主要分為趨化性、 趨觸性和趨硬性三種； 趨
觸性指細(xì)胞對微環(huán)境中固定的化學(xué)梯度的響應(yīng)， 如細(xì)胞具有應(yīng)答黏著梯度的運(yùn)動現(xiàn)象。
（A） ： 負(fù)控制基質(zhì)， 0%的粘附對比， 沒有整聯(lián)蛋白（integrin） 條帶， 細(xì)胞隨機(jī)向不同的
方向遷移。
（B） ： 正控制基質(zhì)， 100%的粘附對比， 整聯(lián)蛋白濃度高， 細(xì)胞傾向于在整聯(lián)蛋白條帶上（藍(lán)
色垂直象限里） 進(jìn)行趨觸性遷移。
（C） ： 50%的粘附對比， 整聯(lián)蛋白濃度低， 細(xì)胞傾向于在整聯(lián)蛋白條帶上（藍(lán)色垂直象限里）
進(jìn)行趨觸性遷移， 具有介于負(fù)控制基質(zhì)和正控制基質(zhì)之間的中間的各向異性指數(shù)。
（A-C） ： 不同顏色表示細(xì)胞的運(yùn)動軌跡。


圖 8. 在不同的粘附條件下， T 細(xì)胞在 ICAM-1 基質(zhì)上的遷移特性【5】 。
（A-C） ： 解釋同圖 7： 灰色為細(xì)胞， 紅色為整聯(lián)蛋白條帶， 綠色為細(xì)胞黏附的足跡。
PRIMO 作用： 用 Micropatterning 方法在 ICAM-1 基質(zhì)上創(chuàng)造出不同濃度的整聯(lián)蛋白的條帶，
改變 ICAM-1 基質(zhì)的粘附性， 觀察細(xì)胞在條帶上的遷移（趨觸性） 。
（5） 2D/3D 單個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)
、 左圖： 隨機(jī)地種植細(xì)胞；
右圖： 微孔內(nèi)壁進(jìn)行 Micropatterning（功能化） 后， 可以標(biāo)準(zhǔn)化種植細(xì)胞， 使細(xì)胞在孔內(nèi)
呈現(xiàn)一致的形狀。

左上圖： 細(xì)胞種在沒有包被的微孔中；
右圖： 包含 1080 個微孔（直徑 60um， 高 30um） 的共聚焦圖像， 微孔的底部和內(nèi)壁粘附有纖
維連接蛋白（fibronectin） -羅丹明， HFF 細(xì)胞（human foreskin fibroblasts， 人包皮成
纖維細(xì)胞） 在微孔中培養(yǎng) 1 天， 進(jìn)行 TRITC 染色以顯示細(xì)胞形態(tài)。
左下圖： 放大圖， 共聚焦圖像和相差圖像重疊， 對 80%的粘附在圖案上的細(xì)胞， 50%有合適
的 3D 結(jié)構(gòu)以進(jìn)行分析。

PRIMO 作用： 當(dāng)沒有用 PRIMO 時， 細(xì)胞在微孔中有不同的形態(tài)， 無法對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究；
當(dāng)用 PRIMO 進(jìn)行 micropatterning 時， 細(xì)胞在微孔中受到控制， 實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)， 因此可以
對多個細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取， 進(jìn)行高通量研究。

（ 6） 粘附多種蛋白

圖 11.用 3 色熒光顯微鏡圖像重現(xiàn)的彩色的微米級名畫： “ the Birth of Venus by
Botticelli” 【 8】 。 這幅復(fù)雜的微米級圖案由 3 種不同的熒光分子（ GFP、 Pll-g-PEG-TRITC
和 Neutravidin-Ato647） 組成， 這 3 種分子依次序印刷在蓋玻片上， 比例尺為 50µm。
PRIMO 實驗： 把原始圖案分成 3 幅不同顏色的灰階圖案， 分別蝕刻； 在每步蝕刻和吸附一種
熒光分子之后， 加入 PLL-g-PEG 溶液孵育， 再加一層防污涂層（ antifouling layer） ， 阻
礙空白區(qū)域上的進(jìn)一步吸附， 然后進(jìn)入下一步的蝕刻和吸附另一種熒光分子。

（ 四） 總結(jié)

PRIMO 強(qiáng)大的生物建模能力和對細(xì)胞微環(huán)境的控制， 可以為多種生物學(xué)實驗帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細(xì)胞遷移、 細(xì)胞黏附、 細(xì)胞趨觸性、 2D/3D 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)、
細(xì)胞球培養(yǎng)、 生物力學(xué)、 組織工程、 微流體等多個領(lǐng)域。

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【8】Pierre-Olivier Strale et. al., Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular
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