（一） 前言

人類(lèi) T 細(xì)胞可以靶向腫瘤特異性的突變是癌癥免疫治療的基礎(chǔ)， 如 Keytruda、 Opdivo這類(lèi) PD-1 靶向的藥物和 Yervoy 這類(lèi) CTLA-4 靶向的藥物，在臨床上都展示出顯著的療效。但目前對(duì)這些藥物有效的患者只占所有患者的大約 1/3，臨床都是通過(guò) IHC 檢測(cè)腫瘤組織切片，來(lái)判斷 PD-1 等靶點(diǎn)的表達(dá)量，從而判斷是否適用這些藥物。而獲取腫瘤組織切片是侵入性的，很多情況下無(wú)法獲得（某些內(nèi)部器官，如肝、肺等部位的組織采樣成功率很低）；如果腫瘤已被切除，那么后續(xù)就無(wú)法重復(fù)取樣，也就無(wú)法進(jìn)行追蹤檢測(cè)。 因此， 獲取這些對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的 T 細(xì)胞是一個(gè)挑戰(zhàn)。 新的研究發(fā)現(xiàn)從腫瘤患者的外周血里也可以分離得到腫瘤突變特異性的 T 細(xì)胞，有助于免疫治療的進(jìn)一步研究【1】。

臺(tái)灣 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有細(xì)胞高效獲取分析系統(tǒng)” 是目前一款集稀有細(xì)胞（包括“循環(huán)腫瘤細(xì)胞 CTCs” 、“稀有免疫細(xì)胞”等）富集與鑒定于一體的全自動(dòng)化設(shè)備，可以從腫瘤患者的外周血里檢測(cè)到對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的稀有免疫細(xì)胞，從而評(píng)估免疫治療對(duì)患者的療效， 并有助于免疫治療的進(jìn)一步開(kāi)展。

（二） 免疫治療研究進(jìn)展

2.1 PD-1+CD8+ T 細(xì)胞是攻擊腫瘤細(xì)胞的主要族群美國(guó) NIH 的科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)如下結(jié)論，見(jiàn)圖 1-5【2】。
 

圖 1. 對(duì)于攻擊腫瘤細(xì)胞的 CD8+ TILs 細(xì)胞， PD-1+是表達(dá)多的族群（32.4%），其次是
TIM-3+（13.0%）、 4-1BB+（10.8%）、 LAG-3+（5.7%）【2】。
 

圖 2. PD-1 和其他 4-1BB、 LAG-3、 TIM-3 受體在 CD8+ TILs 細(xì)胞中有共表達(dá)性，顯然 PD-
1+是主要的族群【2】。



圖 3. 在新鮮腫瘤組織中， TIM-3+、 LAG-3+、 4-1BB+的細(xì)胞，大多數(shù)表現(xiàn)出 PD-1+，如
82.8%的 TIM-3+表達(dá) PD-1、 79.3%的 LAG-3+表達(dá) PD-1、 78.6%的 4-1BB+表達(dá) PD-1，說(shuō)明
PD-1+仍然是主要的族群【2】。

圖 4. 不管 4-1BB 是陰性還是陽(yáng)性， 只要 PD-1 陽(yáng)性， 有 PD-1+的 TILs 細(xì)胞在和腫瘤細(xì)胞系
共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞就有溶菌作用【2】。

圖 5. PD-1 的表達(dá)決定了對(duì)腫瘤有反應(yīng)的 CD8+ TILs 細(xì)胞的數(shù)目：對(duì) PD-1+/4-1BB+的 CD8+TILs 細(xì)胞，對(duì)腫瘤有反應(yīng)的百分比高，其次是 PD-1+/4-1BB-的 CD8+ TILs 細(xì)胞，反應(yīng)比例小的是 PD-1-/4-1BB-的 CD8+ TILs 細(xì)胞【2】。

2.2 PD-1+CD8+ T 細(xì)胞比例高的人，對(duì)免疫治療反應(yīng)較好對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者，用 PD-1 免疫阻斷劑治療時(shí)， PD-1+CD8+細(xì)胞比例高的人，對(duì)免疫治療反應(yīng)較好【3】，見(jiàn)圖 6-7。

圖 6.對(duì)于免疫治療有反應(yīng)的患者， PD-1T （高表達(dá)） TILs 細(xì)胞在所有細(xì)胞中的比例和單位面積的數(shù)量均高于沒(méi)有反應(yīng)的患者【3】。
 

圖 7. PD-1T （高表達(dá)） TILs 細(xì)胞＞1%的患者，總體生存率（OS）要高于＜1%的患者【3】。

2.3 液體活檢研究稀有免疫細(xì)胞

以往 TILs 的分離僅能從腫瘤組織中獲取，但組織切片的獲取具有很多不便性及侵入性。現(xiàn)在， 與腫瘤組織內(nèi)部的 TILs 細(xì)胞一樣，在患者的外周血里也能發(fā)現(xiàn)與 TILs 一致的 PD-1+CD8+的 T 細(xì)胞（圖 8）。 腫瘤細(xì)胞的刺激使淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生大量的功能性免疫細(xì)胞，再運(yùn)送到腫瘤組織周?chē)�，所以在外周血中就可以獲取與 TILs 一致的免疫細(xì)胞。 研究外周血循環(huán)中的 CD8+ T 細(xì)胞上的 PD-1 表達(dá)，為研究腫瘤組織內(nèi)部的抗腫瘤 T 細(xì)胞提供了一扇窗戶，也成為進(jìn)行免疫治療的標(biāo)志物， 有助于分離出對(duì)腫瘤有反應(yīng)的 CD8+ T 細(xì)胞，進(jìn)行免疫治療【1】。

圖 8.外周血循環(huán)中可以分離出新抗原特異性的 PD-1+ T 細(xì)胞【1】。

2.4 流式細(xì)胞儀很難檢測(cè)到外周血中的稀有免疫細(xì)胞

圖 9. 在黑色素瘤患者的外周血中，也能發(fā)現(xiàn)新抗原特異性的淋巴細(xì)胞。與腫瘤組織內(nèi)部
 

相比，外周血（PBMC）中的 PD-1+CD8+的 T 細(xì)胞數(shù)量非常少，流式細(xì)胞儀幾乎無(wú)法檢測(cè)到【4】。

（三） MiSelect R 檢測(cè)稀有免疫細(xì)胞

3.1 MiSelect R 的高靈敏度

由于 MiSelect R 的創(chuàng)新性設(shè)計(jì)， 其對(duì)稀有細(xì)胞的捕獲和鑒定具有高特異性和高靈敏度， 對(duì)于細(xì)胞數(shù)很稀少的族群 (<100 cells/mL) ， 流式細(xì)胞儀已經(jīng)無(wú)法檢測(cè)到，而MiSelect R 可以檢測(cè)（圖 10）【5】。 因此可以用 MiSelect R 來(lái)檢測(cè)極微量的外周血中的稀有免疫細(xì)胞。
 

圖 10. 對(duì)于細(xì)胞數(shù)很稀少的族群 (＜100 cells/mL) ， 流式細(xì)胞儀已經(jīng)無(wú)法檢測(cè)到，而MiSelect R 可以檢測(cè)到； 而對(duì)于＞100 cells/mL 的族群， MiSelect R 檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)量，幾乎是流式的 2 倍以上，說(shuō)明 MiSelect R 的靈敏度比流式更高【5】。

3.2 外周血稀有免疫細(xì)胞數(shù)量對(duì)療效的影響
 

科學(xué)家研究了“肝細(xì)胞癌”和“腎細(xì)胞癌”的 anti-PD1（Keytruda） 免疫治療， 對(duì) 36名“肝細(xì)胞癌”患者和 10 名“腎細(xì)胞癌”患者， 在免疫治療之前抽取患者的外周血， 用MiSelect R 檢測(cè)稀有免疫細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 外周血里稀有 PD-1+CD8+ T 細(xì)胞和PD1+CD4+ T 細(xì)胞數(shù)目多的患者，其總生存率（OS）和無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）均明顯高于此類(lèi)稀有 T 細(xì)胞數(shù)目少的患者（圖 11-13）【5】。
 

圖 11.肝細(xì)胞癌患者的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 細(xì)胞（攻擊性 T 細(xì)胞） 數(shù)目與 OS 的關(guān)系【5】。


圖 12.肝細(xì)胞癌的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 細(xì)胞（攻擊性 T 細(xì)胞） 數(shù)目與 PFS 的關(guān)系【 5】。



圖 13. 腎細(xì)胞癌的外周血稀有 PD-1+CD4+ T 細(xì)胞（調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞） 數(shù)目與 PFS 的關(guān)系【 5】。

3.3 其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑的研究

目前針對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖 14，可見(jiàn)有部分研究是針對(duì)稀有的免疫檢查靶點(diǎn)的，如 TIM-3、 LAG-3、 VISTA、 KIR， 因?yàn)?MiSelect R 是通過(guò)抗體來(lái)標(biāo)記免疫細(xì)胞上的 marker， 所以 MiSelect R 均可有助于此類(lèi)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展【6】。
 

圖 14. 免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果【6】。

3.4 MiSelect R 檢測(cè)稀有免疫細(xì)胞的影像

圖 15. MiSelect R 檢測(cè)結(jié)直腸癌患者的稀有免疫細(xì)胞的影像，可見(jiàn)可以針對(duì) IFN-r、 TIM-

3、 LAG-3 靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記【5】。

（四） MiSelect R 介紹

臺(tái)灣 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有細(xì)胞高效獲取分析系統(tǒng)” 是目前一款集稀有細(xì)胞（包括“循環(huán)腫瘤細(xì)胞 CTCs” 、“稀有免疫細(xì)胞”等）富集與鑒定于一體的全自動(dòng)化設(shè)備，技術(shù)法寶包括微流控技術(shù)、激光分選、體積過(guò)濾和熒光標(biāo)記成像，既可以對(duì)稀有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、分析和鑒定（生物標(biāo)志物分析），又可以獲得高捕獲率、高純度、高活性的稀有細(xì)胞，供下游研究使用。

MiSelect R 的原理見(jiàn)： 稀有細(xì)胞檢測(cè)的突破——MiSelect R 助力稀有免疫細(xì)胞檢測(cè)。

圖 16. Miselect R 稀有細(xì)胞高效獲取分析系統(tǒng)，全自動(dòng)，省時(shí)省力。

（五） 總結(jié)

和市面上其他稀有細(xì)胞檢測(cè)方法不同， MiSelect R 可對(duì)稀有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、分析、鑒定，并獲得活細(xì)胞。具有高純度（>60%） 、高捕獲率（98.5%） 、高細(xì)胞活性（>99%） 、 高檢測(cè)靈敏度、 可重復(fù)性（CV<10%） 、可視性、 廣譜性以及全自動(dòng)運(yùn)行（操作簡(jiǎn)單，全血上樣，全自動(dòng)運(yùn)行，單機(jī)集成）等優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè) EpCAM 低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株，靈敏度是流式細(xì)胞儀的 2 倍。可用于 CTCs 研究、癌癥藥物的伴隨診斷、稀有功能性免疫細(xì)胞研究，或產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，是非常強(qiáng)大的稀有細(xì)胞高效獲取分析系統(tǒng)。

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Investigation, Volume124, No.5, 2014, pp.2246-2259.
【3】 Thommen,D.S.,et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1+
CD8+ T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer
treated with PD-1 blockade, Nature Medicine,
https://doi.org/10.1038/s41591-018-0057-z.
【4】 Gros,A.et.al., Prospective identification of neoantigen-specific
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Medicine, published online 22 February 2016.
【5】 MiCareo Clinical Project Documents.
【6】 Website: ClinicalTrials.gov