臺盼藍(lán)排除法目前得到美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)的認(rèn)可,是細(xì)胞治療中總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力評估的標(biāo)準(zhǔn)。然而,隨著細(xì)胞治療的發(fā)展,對于復(fù)雜的細(xì)胞樣本如免疫細(xì)胞、原代細(xì)胞和干細(xì)胞,臺盼藍(lán)方法的局限性越來越明顯,其特點(diǎn)是高估了細(xì)胞活力、紅細(xì)胞污染等。
為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn),基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法被引入。這些技術(shù)利用選擇性靶向細(xì)胞核的熒光染料,不受碎片或紅細(xì)胞的影響,確保細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力評估更加精確。工業(yè)生產(chǎn)上迫切需要擴(kuò)大基于熒光的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器的使用,以加快研發(fā)速度和生產(chǎn)效率。
意識到這些局限性,韓國食品藥品安全部(MFDS)更新了其細(xì)胞治療產(chǎn)品指南,支持使用帶有熒光核染色的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。NanoEnTek處于前沿,提供全系列先進(jìn)的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。
NanoEnTek 的產(chǎn)品系列包括 ADAM™ MC2/CellT 和ADAM™ MC Plus/CellT Plus。此外,NanoEnTek 還提供先進(jìn)的 3 熒光通道細(xì)胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx。對于需要高通量和高精度的用戶,NanoEnTek 的高通量雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀EVE™ HT FL 脫穎而出,尤其適用于細(xì)胞治療研究和制造。有了這些先進(jìn)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,熒光細(xì)胞核染色方法為評估細(xì)胞治療過程中的細(xì)胞活力提供了更可靠、更高效的支撐。
1. 現(xiàn)行美國 FDA 和 EMA 指南
目前,美國 FDA 和 EMA 認(rèn)可臺盼藍(lán)排除法(手動(dòng)和自動(dòng))作為細(xì)胞治療質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而,這種方法具有局限性,使其不太適合復(fù)雜的細(xì)胞治療。例如,與基于熒光的方法相比,基于臺盼藍(lán)的活力往往高估了細(xì)胞活力,樣品中存在的紅細(xì)胞使總細(xì)胞計(jì)數(shù)不可靠,而基于臺盼藍(lán)的手動(dòng)計(jì)數(shù)本質(zhì)上是主觀的,并且更具可變性。為了解決這個(gè)問題,監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)部分批準(zhǔn)了基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
從工業(yè)角度來看,擴(kuò)大基于熒光的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器的使用需求不斷增長。這樣做不僅可以加快研發(fā)過程,還可以提高生產(chǎn)效率。將批準(zhǔn)范圍擴(kuò)大到包括自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以大大提高細(xì)胞治療生產(chǎn)的質(zhì)量和效率。
2. 傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的局限性:臺盼藍(lán)排除法
(1)臺盼藍(lán)排除法的定義
臺盼藍(lán)排除測定是測定細(xì)胞活力的最早和最常用的方法之一。臺盼藍(lán)(偶氮染料)染色機(jī)制背后的原理是基于細(xì)胞膜的差異通透性。
活細(xì)胞具有完整且功能性的細(xì)胞膜,可選擇性地允許某些分子通過。臺盼藍(lán)顆粒由于其大小和電荷,可以滲透到無活力細(xì)胞受損或受損的膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間。
正常情況下,細(xì)胞內(nèi)環(huán)境尤其是細(xì)胞質(zhì),由活躍的過程維持,例如在健康細(xì)胞的情況下,ATP 依賴性離子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些細(xì)胞利用 ATP 能量,通過稱為胞吐作用的過程主動(dòng)擠出臺盼藍(lán)顆粒,有效地從細(xì)胞內(nèi)空間去除染料并防止細(xì)胞被染色。
相反,無活力或死細(xì)胞缺乏產(chǎn)生 ATP 的能力,因此無法進(jìn)行胞吐作用。結(jié)果,它們將臺盼藍(lán)染料保留在細(xì)胞質(zhì)中,導(dǎo)致它們在顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色或染色。
通過使用這種染色方法,研究人員可以直接識別和計(jì)數(shù)給定群體中的活細(xì)胞(未染色)和死細(xì)胞(藍(lán)色)。
(2)臺盼藍(lán)排除法的局限性
過去,基于細(xì)胞的研究主要利用永生化細(xì)胞系,例如 CHO 細(xì)胞。然而隨著細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展,正在使用更復(fù)雜的樣本類型,包括原代細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞(PBMC)、干細(xì)胞、解離的腫瘤細(xì)胞,甚至工程化的 T 細(xì)胞。這些細(xì)胞的大小、形狀和聚集特性各不相同,因此傳統(tǒng)的臺盼藍(lán)排除法在獲得準(zhǔn)確結(jié)果方面并不完全可靠,尤其是對于 PBMC、干細(xì)胞和原代細(xì)胞等異質(zhì)性樣品。
以下是臺盼藍(lán)排除法的一些局限性:
首先,臺盼藍(lán)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒。即使是活細(xì)胞最終也會被臺盼藍(lán)染色,因?yàn)橛卸救玖蠒䴘B透到細(xì)胞膜中,導(dǎo)致細(xì)胞在接觸后約 5 至 30 分鐘死亡。因此,必須在染料引入后 3 至 5 分鐘內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確測量。此外,臺盼藍(lán)為致癌物,不僅對細(xì)胞有害,而且對人類有害,長期接觸后可能導(dǎo)致癌癥。
此外,臺盼藍(lán)可以將死細(xì)胞的形態(tài)改變,可能導(dǎo)致對活力的高估。用臺盼藍(lán)染色后,細(xì)胞立即開始破裂,成為彌漫性物體。臺盼藍(lán)染色后,一些死細(xì)胞可能會消失,導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)不足,從而高估細(xì)胞活力。換句話說,臺盼藍(lán)的毒性會隨著時(shí)間的推移改變活力,從而影響測量準(zhǔn)確性,從而導(dǎo)致低估細(xì)胞群活力。
這些不準(zhǔn)確之處可能會影響細(xì)胞治療的結(jié)果,細(xì)胞治療依賴于對免疫細(xì)胞的準(zhǔn)確測量,這些免疫細(xì)胞將被輸回患者體內(nèi),此外,突出了對改進(jìn)解決方案的需求,例如熒光細(xì)胞核染色法。
3. 細(xì)胞治療生產(chǎn)過程中熒光核染色方法的必要性
在細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)中,從人體血液中提取各種免疫細(xì)胞。然而這些細(xì)胞經(jīng)常被紅細(xì)胞污染,當(dāng)使用傳統(tǒng)的臺盼藍(lán)排除方法時(shí),紅細(xì)胞可能會被錯(cuò)誤地識別為死細(xì)胞。這種污染延伸到細(xì)胞碎片和非細(xì)胞顆粒,導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。此外,在免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)過程中,與 PBMC 混合的紅細(xì)胞無法區(qū)分,導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)值不準(zhǔn)確。這些不準(zhǔn)確之處會顯著影響各種免疫細(xì)胞治療(如 CAR-T 和 NK 細(xì)胞治療)的研究、開發(fā)和生產(chǎn),最終影響基于細(xì)胞的治療的整體質(zhì)量。
此外,與永生化細(xì)胞系相比,從血液、組織或器官中提取的原代細(xì)胞會帶來類似的問題,因?yàn)樗槠拇嬖谙鄬^高。這可能導(dǎo)致碎片被錯(cuò)誤地計(jì)數(shù)為細(xì)胞,進(jìn)一步加劇了總細(xì)胞計(jì)數(shù)的不準(zhǔn)確性,并降低了基于細(xì)胞的療法的研究、開發(fā)、生產(chǎn)和制造的質(zhì)量。
此外,基于臺盼藍(lán)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的局限性也延伸到其對細(xì)胞存活率的影響?偧(xì)胞計(jì)數(shù)值的不一致和不準(zhǔn)確直接影響細(xì)胞活力評估。例如,在明場顯微鏡下檢查時(shí),免疫細(xì)胞(如 PBMC)中豐富的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活力變異系數(shù)(CV %),因?yàn)榕c傳統(tǒng)細(xì)胞系(>10μm)相比,它們的尺寸(8μm)更小。
與傳統(tǒng)細(xì)胞系不同,臺盼藍(lán)染色能夠區(qū)分活細(xì)胞(未染色)和死細(xì)胞(深藍(lán)色),根據(jù)內(nèi)部亮度確定 PBMC 等較小細(xì)胞的活力是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。這一挑戰(zhàn)導(dǎo)致用戶之間存在顯著差異,并且使用傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯微鏡區(qū)分活力的能力較差。
為了緩解這些問題,本司推薦具有細(xì)胞核熒光染色技術(shù)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。這種方法包括對細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色,以獲得一致和準(zhǔn)確的值,而與細(xì)胞大小無關(guān)。使用 PI 或 DAPI 等試劑根據(jù)染色細(xì)胞核的存在對死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以確保準(zhǔn)確性并最大限度地減少外部干擾。
該方法對永生化細(xì)胞系和從血液、組織或器官中提取的原代細(xì)胞均有效,即使存在碎片或紅細(xì)胞污染,也能提供一致且準(zhǔn)確的結(jié)果。使用基于細(xì)胞核熒光染色的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法可確?偧(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測量的高精度和最小的外部干擾,從而實(shí)現(xiàn)可靠的數(shù)據(jù)采集并促進(jìn)研究、開發(fā)和過程管理。
4. 韓國:主動(dòng)修改“細(xì)胞治療產(chǎn)品放行測試指南”
韓國食品藥品安全部(MFDS)最近對其“細(xì)胞治療產(chǎn)品放行測試指南”進(jìn)行了重大更新。此次更新是為了認(rèn)可熒光核染色方法的準(zhǔn)確性和可靠性。因此,使用這種方法的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀現(xiàn)在被正式認(rèn)可為有效的測試程序。
該指南的最新版本指出了臺盼藍(lán)染色方法的局限性,并正式認(rèn)可了同時(shí)使用熒光細(xì)胞核染色法的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。這一發(fā)展是向前邁出的積極一步,它解決了與審批流程相關(guān)的問題,并為使用基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行更準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)打開了大門。
隨著指南的修改,NanoEnTek 的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列包括ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus、3 熒光通道細(xì)胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx 和高通量自動(dòng)雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 EVE™ HT FL,現(xiàn)在可以無縫集成到細(xì)胞治療產(chǎn)品的開發(fā)、制造、生產(chǎn)和臨床試驗(yàn)中。這種基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法被認(rèn)可為有效的檢測程序,可確保獲得準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù),從而有助于細(xì)胞治療產(chǎn)品的整體質(zhì)量和安全性。
5. NanoEnTek 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀:細(xì)胞治療開發(fā)和制造的理想工具
熒光細(xì)胞核染色方法在細(xì)胞治療產(chǎn)品的制造和質(zhì)量控制中以其高精度和可靠性而著稱。NanoEnTek 的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列,包括 ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus 和 ADAMII™ LS/CDx,旨在為總細(xì)胞數(shù)量及其活力提供精確可靠的結(jié)果。
ADAM II 系列能夠使用細(xì)胞表面標(biāo)志物 (CD marker) 進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞識別和絕對計(jì)數(shù)。此外,EVE™ HT FL 是一款高通量熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,可在短短 3 分鐘內(nèi)處理多達(dá) 48 個(gè)樣品。這種卓越的精度和速度使 EVE™ HT FL 成為廣泛應(yīng)用的理想選擇,包括細(xì)胞系和原代細(xì)胞的分析。
ADAM™ 系列、ADAMII™ 系列和 EVE™ HT FL 是非常適合用于細(xì)胞治療的設(shè)備。它們具有高準(zhǔn)確性、可靠性和效率,使其成為細(xì)胞治療領(lǐng)域研究、開發(fā)和生產(chǎn)工藝不可或缺的工具。
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