在當(dāng)前全球化市場下，轉(zhuǎn)基因生物（GMO）的多樣性和復(fù)雜性不斷增加，對GMO檢測實(shí)驗(yàn)室和政策制定者提出了許多新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的qPCR技術(shù)在單次檢測中對GMO數(shù)量的限制使其在成本和效率存在局限性。為了解決這些問題，斯洛文尼亞國家生物研究所在foods發(fā)表了題為“ Fast and Accurate Multiplex Identification and Quantification of Seven Genetically Modified Soybean Lines Using SixColor Digital PCR ”的文章。本研究開發(fā)了一種創(chuàng)新的六色數(shù)字PCR技術(shù)，通過單一檢測實(shí)現(xiàn)對多個(gè)轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)的同時(shí)定量。

 文獻(xiàn)解讀：

本研究探索了六重檢測中量化五種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的能力，也探索了兩個(gè)四重檢測量化七種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的靈活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了該方法具備高度特異性、靈敏度和精確度。

本文遵循dMIQE2020的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和結(jié)果的可靠性。

 應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶ 開發(fā)了六重?cái)?shù)字PCR檢測方法，對五種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體及大豆參考基因lectin(Le1)同時(shí)量化。

▶ 使用真實(shí)樣本驗(yàn)證了該方法在復(fù)雜樣品中量化轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的適用性。

▶ 與傳統(tǒng)的qPCR相比，該多重dPCR方法顯著節(jié)約時(shí)間和成本，提高檢測的效率。

該研究從轉(zhuǎn)基因大豆CRM中提取DNA。非盲樣本包括兩種DNA混合物，分別對應(yīng)六重檢測的五種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體和四重檢測的七種轉(zhuǎn)化體，用于檢測方法的特異性研究。盲樣樣本選擇了四個(gè)來自常規(guī)研究的樣本，用于檢測方法適用性研究。

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、特異性：

在非目標(biāo)材料中沒有觀察到交叉反應(yīng)，表明檢測方法能夠有效區(qū)分目標(biāo)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體。

2、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）：

LOD≤25拷貝/反應(yīng)，LOQ≤50拷貝/反應(yīng)或以下，部分靶標(biāo)低至12拷貝/反應(yīng)。

3、線性：

即使是在極低濃度下，所有靶標(biāo)檢測均顯示出極佳的線性擬合度。

圖1. 6-plex檢測每個(gè)目的基因的線性。右下角顯示了R2值。X軸為每個(gè)反應(yīng)的估計(jì)拷貝數(shù)，Y軸為每個(gè)反應(yīng)的檢測的拷貝數(shù)。

圖4. 4-plex檢測每個(gè)目的基因的線性。右下角顯示了R2值。X軸為每個(gè)反應(yīng)的估計(jì)拷貝數(shù)，Y軸為每個(gè)反應(yīng)的檢測的拷貝數(shù)。

4、數(shù)據(jù)分析優(yōu)化：

研究采用了兩種數(shù)據(jù)分析優(yōu)化方法。

①. 通過空白限（LOB）校正，可以提高LOQ和LOD精確度。

②. 反應(yīng)的合并孔分析，進(jìn)一步降低了LOD，提高了檢測靈敏度。

5、方法適用性：

使用真實(shí)樣本進(jìn)行測試，多重?cái)?shù)字PCR檢測方法適用于量化復(fù)雜樣本中的低濃度轉(zhuǎn)基因成分。證明了dPCR方法在量化復(fù)雜樣品中低GMO含量方面的適用性。

結(jié)論：

本研究展示了GMO多重?cái)?shù)字PCR檢測方法中極具應(yīng)用潛力和適用性，特別是在復(fù)雜樣品和低靶標(biāo)濃度檢測時(shí)，該方法依舊展示出極高的特異性、靈敏度和精確度，為在復(fù)雜樣品中全面分析GMO成分，提供了新思路和新方法。文中同時(shí)強(qiáng)調(diào)，在當(dāng)下轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日益多樣化的趨勢下，采用創(chuàng)新技術(shù)進(jìn)行有效地和高通量GMO檢測方法非常重要。

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