基于肝星狀細(xì)胞的糖酵解在空間上調(diào)節(jié)纖維性細(xì)胞外囊泡的釋放和放大肝纖維化的研究

全世界每年約有200萬人死于肝病和肝硬化。最近，大量研究人員致力于了解細(xì)胞和分子異質(zhì)性如何促進(jìn)肝纖維化向肝硬化發(fā)展。這種異質(zhì)性包括一種特殊的肝星狀細(xì)胞(HSC)亞群，它通過肝臟特定區(qū)域的高細(xì)胞外基質(zhì)沉積來驅(qū)動(dòng)肝纖維化。纖維化向肝硬化的進(jìn)展是由于造血干細(xì)胞的激活，包括增殖、遷移和肌成纖維轉(zhuǎn)化，初步研究表明，HSC活化與代謝重編程有關(guān)，包括通過糖酵解增強(qiáng)葡萄糖代謝，以滿足高能量需求。研究表明，糖酵解酶的藥理抑制可減少體內(nèi)肝纖維化。

美國研究人員基于肝星狀細(xì)胞的糖酵解在空間上調(diào)節(jié)纖維性細(xì)胞外囊泡的釋放和放大肝纖維化的研究。在這項(xiàng)研究中，通過使用Apogee納米流式、單細(xì)胞、空間、大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，證明了HSC特異性糖酵解在空間調(diào)節(jié)控制肝纖維化擴(kuò)增的特定途徑中的作用。更具體地說，研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞中的糖酵解不是肝纖維化的結(jié)果，而是肝纖維化的驅(qū)動(dòng)因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)HSC特異性糖酵解通過表觀遺傳機(jī)制促進(jìn)了纖維性中心周圍區(qū)EVs相關(guān)基因的表達(dá)。最后，研究證明糖酵解依賴性EVs在體內(nèi)放大肝纖維化，這是一種持續(xù)纖維化和肝臟疾病的機(jī)制。

在本研究中通過使用Apogee納米流式儀和其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證了血小板衍生生長因子-β（PDGF）介導(dǎo)的糖酵解促進(jìn)EV釋放的相關(guān)機(jī)制。EVs部分來源于多泡體(MVBs)的腔內(nèi)囊泡(ILVs)。因此，檢查了糖酵解對(duì)每MVB中ILVs數(shù)量的影響。實(shí)驗(yàn)分組除了對(duì)照外和糖酵解抑制劑-脫氧葡萄糖（2-DG）還有葡萄糖分別處理原代人造血干細(xì)胞。與對(duì)照相比，2-DG顯著降低了MVBs中ILVs的數(shù)量，以及MVB標(biāo)記物CD63的熒光水平（圖6A）。葡萄糖的存在增加了從培養(yǎng)基中分離的EV標(biāo)記物CD81的水平，當(dāng)糖酵解被2-DG抑制時(shí)，該標(biāo)記物被顯著降低(圖6B)。研究了PDGF介導(dǎo)的糖酵解如何影響EVs釋放。本研究通過短發(fā)夾RNA (shRNA)敲除原代人造血干細(xì)胞中的己糖激酶2（ HK2），在mRNA和蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了這一點(diǎn)(圖6C和D)。通過CD81蛋白水平和納米顆粒跟蹤分析(NTA)可以證明，與對(duì)照相比，PDGF增強(qiáng)了EV在media中的釋放，而HK2敲除會(huì)消除這種釋放(圖6E)�？紤]到糖酵解影響EV通路，我們選擇RAB31作為模型，我們下一步研究RAB31在EV釋放中的非典型作用。通過納米流式細(xì)胞術(shù)檢測，研究發(fā)現(xiàn)PDGF介導(dǎo)的EV釋放在siRNA介導(dǎo)的RAB31敲低后被消除(圖6F和G)。與這些結(jié)果一致，培養(yǎng)基中EVs組分中的EVs標(biāo)記物CD81和腫瘤易感基因101 (TSG101)隨著PDGF的增加而增加，并通過敲除RAB31而消失(圖6H)。

圖6所示。PDGF介導(dǎo)的糖酵解通過RAB31促進(jìn)EV釋放

在這項(xiàng)研究中，通過使用Apogee納米流式儀、單細(xì)胞、空間、大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，證明了HSC特異性糖酵解在空間調(diào)節(jié)控制肝纖維化擴(kuò)增的特定途徑中的作用。觀察到HSC特異性糖酵解通過表觀遺傳機(jī)制促進(jìn)了纖維性中心周圍區(qū)EV相關(guān)基因的表達(dá)。最后，本研究提供證據(jù)證明糖酵解依賴的EV在體內(nèi)放大肝纖維化，這是一種持續(xù)纖維化和肝臟疾病的機(jī)制（圖8）。

圖8所示。研究的總體圖例

結(jié)論

造血干細(xì)胞中的糖酵解通過促進(jìn)肝中心周圍區(qū)纖維化性EVs的釋放而放大肝纖維化。針對(duì)HK2或其他糖酵解酶的有效糖酵解藥物抑制劑目前尚未在臨床治療肝纖維化中得到探索，這為藥物開發(fā)確定了一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。此外，Apogee納米流式數(shù)據(jù)，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集與單細(xì)胞和大量RNA-seq數(shù)據(jù)集相結(jié)合，可用于識(shí)別肝纖維化期間纖維化區(qū)上調(diào)和活化HSC的其他靶標(biāo)。總之，抑制糖酵解酶如HK2和隨后的表觀遺傳機(jī)制可能是治療肝纖維化的靶點(diǎn)。

Summary

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測 （如免疫細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

參考文獻(xiàn)

Glycolysis in hepatic stellate cells coordinatesfibrogenic extracellular vesicle release spatially toamplify liver fibrosis
OXFORD BIOLOGY Methods & Protocols,Biology Methods and Protocols,2024, bpae009
Advance Access Publication Date: 13 February 2024
Methods Article: Biomolecular, Structural and Biophysical AnalysisA methodological primer ofextracellular vesiclesisolation and characterization via different techniques

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