外泌體是一種直徑為20 - 150nm的膜結合生物納米囊泡，主要由內(nèi)吞膜產(chǎn)生，并通過胞吐作用釋放。它們在20世紀80年代初被首次發(fā)現(xiàn)，是網(wǎng)狀細胞釋放的含有轉鐵蛋白受體(TfR)的小膜泡，并被證明以旁分泌或內(nèi)分泌方式調(diào)節(jié)生物過程，并運輸各種物質(zhì)，包括信使RNA (mRNA)、microRNA (miRNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。正因為如此，外泌體在治療和診斷領域引起了人們的關注，包括它們作為納米載體將藥物/分子物質(zhì)運輸?shù)桨悬c、治療應用和作為生物標志物。

加拿大西安大略大學的科研人員通過不同分離技術和表征細胞外囊泡的方法制定了基礎的入門方案。在本研究中通過使用四種分離方法來獲取細胞外囊泡，并且使用Apogee納米流式儀對分離后的細胞外囊泡進行表征。包括:(i) 補充聚乙二醇和氯化鈉條件培養(yǎng)基后進行低速離心;(iii)通過100 kda排除過濾器過濾條件介質(zhì);(iv)使用標準商用試劑盒進行分離。然后在分離外泌體之前，將該培養(yǎng)基中的細胞和碎片去除，通過0.2 mm過濾器過濾，并補充蛋白酶和RNAse抑制劑。純化后的EVs可立即使用，或在4℃下穩(wěn)定保存(長達一周用于成像或下游EVs實驗)，或在- 80℃下長時間保存，然后用于生化研究。本研究的目的不是比較這些方法，而是向有需要的人提供所描述方法，以便研究人員可以在各自的條件下選擇 “最佳方法”分離細胞外囊泡。

富集培養(yǎng)基（ECM）中加入50%聚乙二醇(PEG) 8000溶液(在ddH2O中)至終濃度為10% PEG，通過倒置混合均勻，加入NaCl至終濃度為75 mM，再通過倒置混合。然后將混合物在4℃下孵育4 - 16小時。與極短的孵育時間相比，較長的孵育時間可能會增加外泌體的產(chǎn)量。然后將樣品在16000g下在4℃下離心1小時，沉淀外泌體部分。然后將顆粒重懸在1xPBS中。為了去除顆粒中任何殘留的污染物，再次重復此過程。最終的外泌體富集部分保存在1xPBS中，4℃短期保存(天)，- 20℃長期保存(月)，最好在- 80℃保存，但在后一種情況下，應謹慎使用低蛋白結合管。(a)PEG 8000增加了EV的沉降系數(shù)，因此可以通過低速離心分離EVs。(b)散點圖的流式細胞術顯示HEK293或SH-SY5Y細胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標記的CD9抗體陽性EV）。

圖2�；�于PEG8000的EV分離。
 

富集培養(yǎng)基（ECM）在4℃下以10萬g離心75-90分鐘，使用適合超離心的離心管使EV聚集成沉淀。采用針穿刺技術，從管中抽出上清，在底部留下外泌體富集沉淀;將EV重懸于100 mL含蛋白酶抑制劑和RNAseOUT的冰PBS中 。(a)EV在4℃下超速離心以100,000g的75分鐘，分離EVs。(b)散點圖的流式細胞術顯示HEK293或SH-SY5Y細胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標記的CD9抗體陽性EV）。

圖3�；�于超離心的EV的分離。 

不同的過濾裝置可能具有不同程度的蛋白質(zhì)結合親和力和EV的截留能力。推薦使用低蛋白結合親和力的過濾器，如ThermoFisher PierceTM protein Concentrator PES, 100K MWCO。在這個過程中，含有外泌體富集部分會截留在過濾器上。(a)示意圖。分泌組的內(nèi)容物通過100 kda的過濾膜后，膜上部的上清含有外泌體富集組分。(b)散點圖的流式細胞術顯示HEK293或SH-SY5Y細胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標記的CD9抗體陽性EV）。

圖4�；�于超濾的EVs分離。
 

根據(jù)下游技術和所需的外泌體純度，外泌體可以被分離出來或進一步純化(通過超離心、蔗糖密度梯度離心或尺寸排阻)。(a)外泌體的內(nèi)含物通過100 kda的過濾膜，然后通過在4℃下以100,000g離心75分鐘，從膜的頂端得到的上清用于進一步純化。(b)散點圖的流式細胞術顯示HEK293或SH-SY5Y細胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標記的CD9抗體陽性EV）。

圖5�；�于超濾-超離心的EV分離

有幾種商業(yè)試劑盒用于從不同的生物樣品或細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中分離和純化外泌體。這些試劑盒通常是基于聚合物沉淀與SEC或過濾相結合。雖然使用試劑盒可以快速提供純外泌體，但產(chǎn)量可能低于“金標準”方法（如超速離心法），并且相關的成本可能使一些實驗室望而卻步。在這里，我們使用了一個商業(yè)套件（Exo- spinTM mini (Cell Guidance Systems LLC, USA)，它同時依賴于沉淀和SEC。（a）基于Exo-spinTM迷你試劑盒的外泌體分離試劑盒示意圖。外泌體溶解于試劑盒緩沖液中，離心沉淀，重懸于PBS中，然后應用于SEC進行進一步純化。(b)散點圖的流式細胞術顯示HEK293或SH-SY5Y細胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標記的CD9抗體陽性EV）。

圖6。基于試劑盒的外泌體提取。

結論

近年來外泌體治療和診斷的應用呈指數(shù)增長。隨著我們繼續(xù)了解它們的生物發(fā)生和功能，分離和表征外泌體的試劑、技術和方案的不斷發(fā)展也變得至關重要。這些進步強調(diào)了建立完善和標準化方法的必要性，并導致了增強外泌體分離和表征的協(xié)議。這些方法的不斷優(yōu)化已經(jīng)使外泌體從復雜的生物液體(如血液、尿液和組織培養(yǎng)基)中純化出來，使它們成為轉化研究的寶貴資源。然而，由于不存在單一的最佳分離技術，因此每個實驗室應根據(jù)研究目的、下游應用以及可用的資源/設備來選擇合適的方法。

Summary

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設計，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對定量，多標記物同時快速分析工作中廣泛應用。截止目前，該設備已累計參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關實驗分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認可，并將繼續(xù)為EVs相關基礎研究及轉化應用提供堅實支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級別的顆粒 （如：細胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動物細胞檢測 （如免疫細胞、哺乳類動物細胞、等）。它是一臺全面且功能強大的納米流式分析儀！

參考文獻

OXFORD BIOLOGY Methods & Protocols,Biology Methods and Protocols,2024, bpae009
Advance Access Publication Date: 13 February 2024
Methods Article: Biomolecular, Structural and Biophysical AnalysisA methodological primer ofextracellular vesiclesisolation and characterization via different techniques

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