疫苗接種是預(yù)防和控制傳染病傳播最具效益的方法之一。病原體及其代謝物被制備成一種免疫制劑，可通過人工衰減、解毒、失活或基因工程等方法實(shí)現(xiàn)傳染病防控^[1]。傳統(tǒng)疫苗，包括減毒活疫苗和滅活疫苗，可在宿主細(xì)胞中引起強(qiáng)烈和長(zhǎng)期有效的免疫反應(yīng)，因此在疫苗市場(chǎng)上占有突出地位。

出于對(duì)傳統(tǒng)疫苗潛在病原性、難以生產(chǎn)等因素的考慮，一些新型疫苗，特別是基于病毒樣顆粒（Virus-Like Particles，VLPs）的基因工程疫苗，因具有更強(qiáng)的免疫原性和安全性而受到廣泛關(guān)注（Fig.1）^[2]。

Fig.1 疫苗分類
 

從結(jié)構(gòu)上來說，VLPs可以分為無包膜VLP 與有包膜VLP（Fig.2），VLP疫苗甚至可構(gòu)建雙層、三層包膜，實(shí)現(xiàn)多價(jià)疫苗與多聯(lián)疫苗的效果。

無包膜VLPs，如HPV、HEV等疫苗，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，可在原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中表達(dá)，尤其是表達(dá)量高和易放大的大腸桿菌與酵母表達(dá)系統(tǒng)。

包膜VLPs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要宿主膜參與構(gòu)建，可選擇在酵母、昆蟲細(xì)胞以及植物細(xì)胞等真核系統(tǒng)中表達(dá)^[3]。不同的表達(dá)系統(tǒng)在VLP的含量和完整VLP的比率上有差異，進(jìn)而影響免疫原性。

Fig.2 無包膜VLPs與包膜VLPs
 

Table 1.已上市的病毒顆粒樣疫苗

迄今為止，HBV的VLP疫苗已經(jīng)開發(fā)了三代。Heptavax-B是一代疫苗，該疫苗是從乙肝患者血樣中分離得到乙肝表面抗原顆粒，屬于滅活疫苗。

出于對(duì)一代疫苗安全性和來源不確定性的考慮，第二代基于HBV VLPs的基因工程疫苗Recombivax HB（MSD）和Engerix-B（GSK）獲批上市，兩者均使用釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)HBsAg（具有規(guī)則的正二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)）。2018年，在漢遜酵母中表達(dá)的含有重組HBsAg及兼具Toll-like receptor 9激動(dòng)劑佐劑的新型乙肝疫苗Heplisav-B批準(zhǔn)上市，其免疫原性高于Engerix-B（接種3針，每針間隔6個(gè)月），僅接種2針即可（每針間隔1個(gè)月）。

第二代疫苗僅含有單一抗原（Small S Antigen of HBsAg），疫苗實(shí)現(xiàn)血清保護(hù)的時(shí)間長(zhǎng)。因此，為提高乙肝疫苗的有效性和保護(hù)效力，第三代疫苗Sci-B-Vac（PreHevBrio）在CHO細(xì)胞中表達(dá)了三種HBV表面抗原（S, pre-S1 and pre-S2），混合了糖基化和非糖基化HBsAg的VLPs，更接近天然結(jié)構(gòu)而具有更高的免疫原性^[5]。

Table 2.二代、三代乙肝疫苗對(duì)比

四價(jià)Gardasil（MSD）是第一個(gè)被批準(zhǔn)作為人乳頭瘤病毒（HPV）預(yù)防性的疫苗。在酵母中表達(dá)得到的重組蛋白L1自組裝成VLP，主要為HPV 6/11/16/18這四種HPV類型引起的病毒感染提供保護(hù)。2014年，默沙東公司進(jìn)一步推出的九價(jià)疫苗Gardasil-9，有著更高的總抗原量和鋁佐劑含量，除了Gardasil提供的預(yù)防HPV 6/11/16/18病毒之外，該疫苗還對(duì)HPV 31/33/45/52/58病毒具有額外的預(yù)防作用。

2009年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種名為Cervarix（GSK）的二價(jià)疫苗。該疫苗采用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，主要靶向HPV 16/18，因?yàn)镃ervarix擁有一種新型的AS04佐劑系統(tǒng)，對(duì)HPV 16/18具有更好的免疫原性和長(zhǎng)期保護(hù)作用。

2019年12月，馨可寧正式獲得國(guó)家醫(yī)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在中國(guó)使用，用于HPV 16/18預(yù)防。相比酵母和昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，馨可寧應(yīng)用的大腸桿菌（E.coli）表達(dá)體系可以節(jié)省成本。

同樣用于預(yù)防HPV 16/18的沃澤惠于2022年5月在中國(guó)批準(zhǔn)上市，該疫苗則由畢赤酵母表達(dá)。

Fig.3 HPV疫苗^[6]

截至2022年12月31日，中國(guó)正處于臨床研究階段的人乳頭瘤病毒疫苗共有20種。其中瑞科生物、萬泰生物、沃森生物、博唯生物、康樂衛(wèi)士的九價(jià)HPV疫苗以及相關(guān)產(chǎn)品已進(jìn)入Ⅲ期臨床階段^[7]。

人乳頭瘤病毒含有兩種病毒編碼的蛋白質(zhì)，分別為 L1 和 L2。這兩種蛋白質(zhì)形成二十面體衣殼， L1 是主要的結(jié)構(gòu)蛋白。目前，已上市的預(yù)防性HPV疫苗都是基于僅含有L1蛋白的自組裝VLPs，因?yàn)長(zhǎng)1蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以自組裝成具有高免疫原性的VLPs，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的類型特異性免疫應(yīng)答。微小衣殼蛋白L2作為HPV類型中高度保守的蛋白，被認(rèn)為是開發(fā)下一代泛HPV疫苗的合適靶點(diǎn)。

Schellenbacher等人構(gòu)建了一種同時(shí)表達(dá)L1和L2蛋白的嵌合HPV疫苗（HPV 16 L1-HPV 16 L2），并在佐劑誘導(dǎo)下針對(duì)HPV 16產(chǎn)生廣譜中和抗體^[8]。

Fig.4 HPV 結(jié)構(gòu)蛋白

VLPs表達(dá)系統(tǒng)的多樣性也導(dǎo)致下游純化工藝不具有普適性。Fig. 5為一般下游工藝流程圖^[9]。

Fig.5 VLP疫苗的下游工藝流程

純化包括粗純、中間純化及精純等階段。色譜法是VLPs下游工藝的核心操作單元，包括親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩層析以及復(fù)合模式層析。

Fig.6 VLPs純化技術(shù)

Fig.7 CHO細(xì)胞與酵母表達(dá)系統(tǒng)制備HBsAg工藝流程

國(guó)內(nèi)乙肝疫苗有三種技術(shù)路線（Fig.7），分別是CHO細(xì)胞、漢遜酵母和釀酒酵母。酵母細(xì)胞在制備HBsAg時(shí)多為胞內(nèi)表達(dá)，需收獲裂解后澄清，疏水捕獲（HBsAg蛋白的疏水鍵可與疏水配基結(jié)合），流穿模式下陰離子去除大量HCP等雜質(zhì)，分子篩精純?nèi)コ�小分子雜質(zhì)。而CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)多為胞外表達(dá)，料液中含少量HCP，無需裂解過程。CHO含糖基化HBsAg，更接近天然結(jié)構(gòu)，純化過程與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比簡(jiǎn)單，可在粗純階段選擇疏水作用相對(duì)較弱的填料。

博格隆提供系列疏水填料，Diamond HIC系列及Diamond HIC Mustang系列填料是以高剛性瓊脂糖為基架偶聯(lián)相對(duì)應(yīng)的疏水基團(tuán)，反壓低、流速快，適合生物分子的大規(guī)模分離純化。

Fig.8 Diamond Butyl填料

Fig.9 HPV疫苗純化工藝流程

上市HPV疫苗源于大腸桿菌、酵母以及桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞三種表達(dá)系統(tǒng)（Fig.9），下游純化工藝一般以強(qiáng)陽離子捕獲。

博格隆MegaPoly 50 HS具有特殊的孔徑結(jié)構(gòu)，較大的貫穿孔和擴(kuò)散孔可在提供高動(dòng)態(tài)載量的同時(shí)降低擴(kuò)散對(duì)層析的影響，賦予產(chǎn)品高流速、高載量、高分辨率的特性，在捕獲階段提供更快速，更高效的分離純化選擇。后續(xù)通過羥基磷灰石（CHT Ⅱ）、離子或疏水層析進(jìn)行精純。純化過程中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)需注意去除內(nèi)毒素，桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)需注意去除重組桿狀病毒（BV）基因組及HCD。離子交換可顯著去除HCP、HCD以及大腸內(nèi)毒素，不同粒徑的離子交換介質(zhì)可應(yīng)用于捕獲或精純階段。

博格隆Diamond IEX系列填料是將離子交換基團(tuán)偶聯(lián)到帶有葡聚糖長(zhǎng)鏈的高剛性瓊脂糖上，延伸臂增加配基密度從而提高蛋白載量，高效分離純化蛋白。

Fig.10 Diamond DEAE（左）與Diamond Q（右）填料

多模式層析因?yàn)槟芡瑫r(shí)提供不同類型的相互作用力，所以在 VLPs 純化工藝開發(fā)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

博格隆Diamond Layer 400和Diamond Layer 700是新型的多模式純化層析介質(zhì)，分子量排阻分別為400KD和700KD，其雙層結(jié)構(gòu)由具有陰離子和疏水作用的核心微球及具有分子篩作用的薄層鈍化外殼（一層不帶配基的瓊脂糖）組成。小于對(duì)應(yīng)分子量的雜質(zhì)進(jìn)入微球內(nèi)部與配基基團(tuán)結(jié)合，病毒顆粒會(huì)被阻隔在微球外。因此，相對(duì)于傳統(tǒng)分子篩，其最大的優(yōu)勢(shì)在于上樣量大大提高，且在放大過程中可有效減小柱體積。該類介質(zhì)專為病毒和其它生物大分子的中間純化和精細(xì)純化而設(shè)計(jì)，是疫苗生產(chǎn)中病毒純化介質(zhì)的極佳選擇。

Fig.11 博格隆Diamond Layer 700多模式層析填料

為了提高疫苗質(zhì)量，所有表達(dá)系統(tǒng)均需進(jìn)行解聚再復(fù)聚的步驟。因?yàn)殡s質(zhì)除了位于顆粒表面外，還可能結(jié)合在顆粒內(nèi)部，解聚狀態(tài)下純化可更徹底地去除HCP與HCD。

天然HPV顆粒含有L1蛋白與L2蛋白，而目前HPV疫苗不含L2蛋白，導(dǎo)致在組裝過程中出現(xiàn)顆粒不均一的情況，因此解聚后復(fù)聚可以使顆粒均一，增強(qiáng)免疫原性。解聚可以在層析過程中添加適量DTT，后續(xù)復(fù)聚前需置換緩沖液去除還原劑。

為達(dá)到更好的VLPs 疫苗純化效果，下游純化應(yīng)根據(jù)目的抗原的性質(zhì)及表達(dá)體系的復(fù)雜性選擇合適的層析方式，并搭配膜層析技術(shù)提高免疫原性和安全性。

 

參考文獻(xiàn)

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[5] Virus-like particle vaccinology, from bench to bedside. CELLULAR & MOLECULAR IMMUNOLOGY ,19 (9) , pp.993-1011

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[7] 人用疫苗市場(chǎng)發(fā)展現(xiàn)狀與未來趨勢(shì)研究報(bào)告.

[8] Chimeric L1-L2 virus-like particles as potential broad-spectrum human papillomavirus vaccines. JOURNAL OF VIROLOGY, 83 (19) , pp.10085-10095.

[9] Next generation vaccines and vectors: Designing downstream processes for recombinant protein-based virus-like particles. BIOTECHNOLOGY JOURNAL, 10 (5) , pp.715-U100.