細(xì)胞外囊泡(EVs)已被證明在促進(jìn)腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。隨著EV研究的深入，在研究過程中建立標(biāo)準(zhǔn)化的分離、質(zhì)量控制、表征和驗(yàn)證方法作為可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)來作為問題排除解決方案是非常重要的。因此，本研究報(bào)告的目的是從多種乳腺癌細(xì)胞系中分離出EV，并按照國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (International Society for Extracellular Vesicles) 的EV研究最小信息列表(MISEV)描述和執(zhí)行實(shí)驗(yàn)方案。

加拿大科研人員對(duì)乳腺癌來源的細(xì)胞外囊泡的質(zhì)量控制和檢驗(yàn)的研究。本研究采用了兩種EV分離方法:超離心法(UC )和尺寸排阻層析法(SEC)。為了符合MISEV的要求，進(jìn)行了蛋白定量、陽性(CD9、CD63、TSG101)和陰性(TGFβ1、β-微管蛋白)標(biāo)記物的免疫印跡、納米流式細(xì)胞術(shù)（Apogee A60 Micro PLUS）分析和電鏡觀察。通過這些實(shí)驗(yàn)證明了EV的產(chǎn)量在不同的乳腺癌細(xì)胞系之間存在差異。本課題對(duì)EV研究方案進(jìn)行了優(yōu)化，以適應(yīng)低產(chǎn)量EV的表征，并包括各種技術(shù)和問題排除建議，以更好地應(yīng)用于其他類型細(xì)胞來源的EV，必將對(duì)未來的研究人員帶來益處。

使用DC蛋白檢測試劑盒定量EV樣品的總蛋白濃度。對(duì)于低產(chǎn)量的EV樣品，使用Micro BCA蛋白測定試劑盒定量，樣品稀釋10倍,對(duì)EV蛋白樣品進(jìn)行一致體積(35µL)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

Fig.1

(A)通過超離心(UC)和尺寸排阻層析(SEC)分離后EV CD9和CD63的蛋白水平。SUM159細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)，使用UC或SEC從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離EV。EV蛋白樣品使用一致體積(35µL)進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證。1– 4孔為UC分離的EV,孔1：使用 UC前的EV(培養(yǎng)基);孔2為UC后上清裂解液;孔3為UC后的EV;孔4 為使用Ultra-4離心過濾器(100 kDa)進(jìn)行額外濃縮后的EV�？�5-7為SEC分離的EV,孔5為分離前的EV(培養(yǎng)基),孔6為來自SEC后1-5 EV(混合物);孔7為來自SEC 6-8的EV(混合物)。(B, C)特異性蛋白質(zhì)表征EV，采用超速離心方法從缺氧培養(yǎng)的不同乳腺細(xì)胞系中分離EV，包括MCF10A(非惡性乳腺上皮細(xì)胞)、SUM159、MDA-MB-231(三陰性)、231-BoM(骨轉(zhuǎn)移三陰性)和231-LM2(肺轉(zhuǎn)移三陰性)。

使用Apogee flow系統(tǒng)(A60 Micro PLUS)用于評(píng)估EV樣品中的顆粒大小分布和顆粒的相對(duì)豐度(圖2)。對(duì)于在缺氧條件下獲得的所有乳腺源性EV樣品，大多數(shù)EV的大小都在180 nm范圍內(nèi)，盡管在特定細(xì)胞系中也檢測到更大粒徑的EV。與免疫印跡結(jié)果相似，本研究還觀察到細(xì)胞系之間EV產(chǎn)量(顆粒/µL)的差異，MCF10A和SUM159細(xì)胞的EV產(chǎn)量最低(圖2A, B)， 231-BoM細(xì)胞的EV產(chǎn)量最高(圖2E)。這種EV大小和產(chǎn)量的變化性說明了來自不同患者的乳腺癌細(xì)胞之間的內(nèi)在異質(zhì)性，并強(qiáng)調(diào)了使用多細(xì)胞系模型進(jìn)行癌癥EV研究的重要性。

Fig.2

乳腺源性EV的粒徑分布特征。采用超速離心技術(shù)從MCF10A、SUM159、MDA-MB-231、231-BoM和231-LM2等低氧培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞系中分離出EV。每個(gè)EV樣品用PBS中稀釋10倍，體積為300µL使用Apogee A60 Micro PLUS納米流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。(A-D) MCF10A、(B) SUM159、(C) MDA-MB-231、(D) 231-LM2和(E) 231- BoM乳腺細(xì)胞系EV樣品的顆粒數(shù)(y軸)和粒徑(x軸)分布。顆粒數(shù)/µL表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n= 2)，并歸一化為收獲時(shí)的細(xì)胞數(shù)。流式圖顯示了小角度光散射(SALS)和大角度光散射(LALS)，并在圖中做了量化處理。不同粒徑的標(biāo)準(zhǔn)珠(180nm, 240nm, 300nm, 580nm, 880 nm和1300nm)在細(xì)胞圖上用圓圈表示。

本研究進(jìn)行了TEM陰性染色，與之前的文獻(xiàn)結(jié)果一致，觀察到在缺氧條件下分離的乳腺源性EVs可視為圓形結(jié)構(gòu)(圖3)。然而，根據(jù)制備和試劑的不同，EVs也可以呈現(xiàn)杯狀。在高分辨率透射電鏡下，如細(xì)胞碎片，會(huì)產(chǎn)生背景污染，干擾電子顯微鏡成像。通過使用的PBS洗滌，確保顆粒完全重懸浮，并沖洗樣品以去除緩沖鹽粒子，可以提高圖像質(zhì)量�？梢栽诓幌♂尩那闆r去除污染物，這對(duì)于低產(chǎn)量樣品(即來自MCF10A, SUM159細(xì)胞) 成像至關(guān)重要。

Fig.3

圖3透射電子顯微鏡(TEM)表征EV的形態(tài)。采用超離心技術(shù)從MCF10A、SUM159、MDA-MB-231、231-BoM和231-LM2等不同的乳腺細(xì)胞系中分離出EV。樣品以3µL體積在PBS中制備，使用JEOL JEM 1200 EX TEMSCAN顯微鏡進(jìn)行透射電鏡觀察。(A) MCF10A， (B) SUM159， (C) MDA-MB-231， (D) 231-LM2， (E) 231- BoM。       

結(jié)論

在進(jìn)行EV研究時(shí)，重要的是要考慮以下因素:所使用的術(shù)語和定義、EV的來源、以及用于分離、濃縮、表征和儲(chǔ)存的技術(shù)。記錄這些參數(shù)將有助于符合MISEV指南要求，并確保研究的方法可以復(fù)制。本研究報(bào)告中描述的驗(yàn)證方案對(duì)有興趣研究EV的研究者有價(jià)值，可以提供克服EV研究過程中遇到的常見問題的參考，并幫助符合MISEV要求，確保整個(gè)EV研究領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)化。

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測 （如免疫細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

參考文獻(xiàn)：
Quality control and validation ofextracellularvesicles isolated from cultured human breastcancer cells. Urvi Patel', David Susman' and Alison L. Allan1.23.4”,(2024) 17:202Pateletal. BMCResearch Notes
 

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