眼部疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變是視力損害和失明的主要原因。據(jù)預(yù)測(cè)，由于人口老齡化，未來(lái)20年全球視網(wǎng)膜疾病患者數(shù)量將增加約45%。現(xiàn)有的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和抗炎藥物通常用于治療后段眼病，但生物屏障嚴(yán)重限制了它們的治療效果。因此，為了克服藥物難以接近靶點(diǎn)的問(wèn)題，大多數(shù)治療視網(wǎng)膜疾病的藥物都是通過(guò)玻璃體內(nèi)注射給藥的。雖然小分子可能會(huì)滲透到整個(gè)視網(wǎng)膜層，它們受到藥物快速清除的影響，因此需要頻繁注射，有極大的感染風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，大分子和納米藥物的視網(wǎng)膜滲透性較低，因此需要改進(jìn)給藥方法以獲得治療效果。

意大利科研人員對(duì)眼內(nèi)遞送地塞米松的脂質(zhì)體進(jìn)行表面特性的研究。本研究開(kāi)發(fā)了具有工程化的表面脂質(zhì)體，以控制其在玻璃體和視網(wǎng)膜中的擴(kuò)散。該研究中使用Apogee Flow System納米流式分析和評(píng)估玻璃體中熒光素標(biāo)記并加載DH（地塞米松）脂質(zhì)體的膠體穩(wěn)定性。氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)/膽固醇脂體包被合成的非肽細(xì)胞滲透增強(qiáng)劑(CPE) (Agm6-M-Oleate) (Agm6-M-Oleate)和/或5%的mPEG2kDa-DSPE。隨著Agm6-M油酸鹽包被濃度的增加，脂質(zhì)體的zeta電位升高，在牛玻璃體中的遷移率和膠體穩(wěn)定性降低。相反，mPEG2kDa- DSPE降低了脂質(zhì)體的zeta電位，恢復(fù)了脂質(zhì)體在玻璃體中的擴(kuò)散性和穩(wěn)定性。

ApogeeFlow納米流式細(xì)胞術(shù)的大角度光散射(LALS)分析評(píng)估玻璃體中熒光素標(biāo)記并加載DH的脂質(zhì)體膠體穩(wěn)定性。該儀器可區(qū)分玻璃體大分子和熒光標(biāo)記脂質(zhì)體的信號(hào)。圖5A顯示了熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)，這些脂質(zhì)體在從玻璃體組分信號(hào)中去除后圈門(mén)。在0天時(shí)LALS值不同表明不同細(xì)胞穿透增強(qiáng)劑與玻璃體的相互作用不同，特別是5% Agm6-Lipo和mPEG/5% Agm6-Lipo的起始值高于Naked-Lipo和mPEG- lipo，這表明它們?cè)诓Ａ�體中發(fā)生了迅速的粒徑變化。Naked- Lipo和mPEG-Lipo的LALS信號(hào)沒(méi)有隨著時(shí)間的推移而增加，表明這些囊泡的大小在玻璃體中是穩(wěn)定的。相反，5%Agm6-Lipo的LALS信號(hào)在20天內(nèi)增加了約50%，表明脂質(zhì)體在玻璃體中逐漸聚集。值得注意的是，通過(guò)包被mPEG-DSPE5%后的Agm6-Lipo顯著降低了LALS信號(hào)的增加，表明玻璃體中脂質(zhì)體具有顯著的PEG保護(hù)作用，這也可以最大限度地減少給藥后對(duì)視力的干擾(圖5B)。

Fig.5

Fig.5所示。37℃玻璃體中載DH脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。A.脂質(zhì)體的ApogeeFlow流式圖。B. 脂質(zhì)體在大角度散射光信號(hào)與時(shí)間的相關(guān)性。

圖7-i中報(bào)告的細(xì)胞熒光結(jié)果顯示，加載DH的脂質(zhì)體的表現(xiàn)與空白脂質(zhì)體相似;陽(yáng)離子脂質(zhì)體比中性脂質(zhì)體具有更高的細(xì)胞關(guān)聯(lián)性。這證實(shí)了藥物裝載不影響囊泡表面，DH不吸附在脂質(zhì)體表面。用共聚焦顯微鏡觀察了加載DH脂質(zhì)體在培養(yǎng)的ARPE19細(xì)胞中的內(nèi)化作用。Fig.7-ii A-B顯示，與不含DH的脂質(zhì)體相似，加載DH的Naked-Lipo和mPEG-Lipo不被細(xì)胞關(guān)聯(lián)或攝取。相反，5%Agm6-Lipo和mPEG/5%Agm6-Lipo顯示出顯著的細(xì)胞關(guān)聯(lián)和對(duì)細(xì)胞質(zhì)的處置(圖7-ii C-D)。然而，這些配方顯示出不同的細(xì)胞結(jié)合和進(jìn)入模式。5%Agm6在細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)中形成大的聚集體，而mPEG/5%Agm6-lipo進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)空間，產(chǎn)生小的熒光點(diǎn)，與不含DH的對(duì)應(yīng)物相似。因此，mPEG涂層似乎可以減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體在細(xì)胞膜附近的聚集，從而促進(jìn)細(xì)胞攝取。

Fig.7

Fig.7在三種脂質(zhì)體濃度下，加載DH的熒光素- DHPE標(biāo)記脂質(zhì)體孵育ARPE-19細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)以Mean±S.D. (n = 3)表示。與加載DH的Naked-Lipo進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ii) 共聚焦顯微鏡下的ARPE-19細(xì)胞與載DH的Naked-Lipo (A)、mPEG- lipo (B)、5%Agm6-Lipo (C)、mPEG/5%Agm6-Lipo (D)共聚焦顯微鏡下的圖像。

所有配方均表現(xiàn)出雙相行為，在前24小時(shí)內(nèi)快速釋放，隨后緩釋超過(guò)30天。這種行為可以解釋為可以迅速釋放的非絡(luò)合DH和緩慢釋放的與Ca2+絡(luò)合的DH之間的平衡。釋放曲線(xiàn)表明，表面處理后的脂質(zhì)體影響DH的釋放。5%Agm6-Lipo與Naked-Lipo相比，釋放速度更快，這表明插入后的寡位置脂質(zhì)部分可能會(huì)影響雙層結(jié)構(gòu)，使其更具滲透性。

Fig.8

Fig.8脂質(zhì)體釋放DH。數(shù)據(jù)以Mean±S.D. (n = 3)表示。
 

結(jié)論：本研究報(bào)告的結(jié)果表明，合成的細(xì)胞滲透增強(qiáng)劑(CPE)和mPEG的結(jié)合可以成功地用于控制膠體藥物遞送系統(tǒng)在玻璃體內(nèi)表現(xiàn)。我們?cè)谶@里已經(jīng)證明，Agm6和mPEG在脂質(zhì)體表面的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)在玻璃體中的擴(kuò)散，在玻璃體內(nèi)治療時(shí)可以達(dá)到視網(wǎng)膜治療的目的。用mPEG包裹Agm6修飾的脂質(zhì)體，在體外和體內(nèi)提供了有效的治療抗炎效果，這是由多種因素共同作用的結(jié)果，包括高效的細(xì)胞內(nèi)藥物傳遞和低細(xì)胞毒性的載體。另一方面，mPEG和Agm6對(duì)脂質(zhì)體/細(xì)胞膜的相互作用、內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)機(jī)制的影響還需要進(jìn)一步的研究。

英國(guó)Apogee超靈敏納米流式分析儀，專(zhuān)為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè) （如免疫細(xì)胞、哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

參考文獻(xiàn)：Tailoring surface properties of liposomes for dexamethasoneintraocular administration
M.D. Al-Amin", Francesca Mastrotto", Astrid Subrizi b,e, Merve Send, Tiina TurunencBlanca Arango-Gonzalez ", Marius Ueffing", Alessio Malfanti", Arto Urtti ',c, Stefano Salmaso ",Paolo Caliceti"

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