細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子(如DNA，RNA等)導(dǎo)入(真核)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已應(yīng)用于研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，其特點(diǎn)是載體基因不整合到細(xì)胞基因組上，而是隨著細(xì)胞分裂而逐漸丟失。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可在短時(shí)間內(nèi)獲取目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，目前常用的瞬轉(zhuǎn)方法有化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，病毒載體轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)等。
 
PEI(聚乙烯亞胺)為化轉(zhuǎn)試劑之一，其原理是帶正電的PEI能將帶負(fù)電的DNA包裹成為帶正電的PEI-DNA復(fù)合物，PEI-DNA復(fù)合物可結(jié)合細(xì)胞表面通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，PEI相比于其他轉(zhuǎn)染試劑有著成本低廉的優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛應(yīng)用。 細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)間較短，相對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)無需將外源基因整合到基因組上，避免了外源基因整合過程中位置效應(yīng)的影響。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一般用于基因產(chǎn)物的短期表達(dá)，進(jìn)行蛋白質(zhì)小規(guī)模合成。
 
那么如何能快速地搭建瞬轉(zhuǎn)平臺(tái)呢？
主要分五步：載體構(gòu)建→質(zhì)粒抽提→細(xì)胞準(zhǔn)備→瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)→純化及質(zhì)量檢測(cè)
  首先要選擇合適的載體，為了使質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，提高瞬轉(zhuǎn)的表達(dá)量，需要選擇與宿主細(xì)胞匹配的表達(dá)載體，另外，為了提升表達(dá)量，表達(dá)載體通常選擇含強(qiáng)啟動(dòng)子的。
 
如果表達(dá)的蛋白含有多條鏈，可以將兩條或兩條以上的鏈構(gòu)建到一個(gè)載體或者多個(gè)載體進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建時(shí)需要注意的點(diǎn)是，目標(biāo)基因前面加上信號(hào)肽和 kozak 序列，構(gòu)建的過程中盡量使用同源重組的方法防止移碼突變，目的基因最后必須加終止密碼子。

  對(duì)于少量的質(zhì)粒抽提，可以選用控內(nèi)毒的質(zhì)粒抽提試劑盒，現(xiàn)在一些國(guó)產(chǎn)的試劑盒完全可以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。對(duì)于大量的質(zhì)粒抽提，可以使用層析的方式，百林科擁有完善的質(zhì)粒純化平臺(tái)，可以針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)要求，提供差異化的質(zhì)粒純化解決方案。
 
抽提的質(zhì)粒通過跑分子膠鑒定大小及純度，OD260/OD280 以及 OD260/OD230 確定質(zhì)粒的質(zhì)量。百林科質(zhì)粒純化平臺(tái)三步法：分子篩(Chromstar^® 6FF)+親和(MaXtar^® Plasmidcap HR)+陰離子(MaXtar^® Q HR) 能協(xié)助客戶解決大規(guī)模質(zhì)粒純化制備的問題。 目前常用的瞬轉(zhuǎn)表達(dá)宿主為 CHO 細(xì)胞和 HEK293 細(xì)胞，均有耐受較高剪切力和滲透壓，表達(dá)水平較高，支持懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。HEK293 細(xì)胞相對(duì)于 CHO 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率方面更有優(yōu)勢(shì)，由于 HEK293 為人源細(xì)胞，適用于表達(dá)翻譯后修飾要求更高的重組蛋白。
 
CHO 細(xì)胞為鼠源細(xì)胞，比 HEK293 細(xì)胞生長(zhǎng)更快，外源蛋白分泌更少，分離純化更簡(jiǎn)便，且 CHO 細(xì)胞在放大生產(chǎn)方面相比于 HEK293 細(xì)胞更為穩(wěn)定，因此大多數(shù)研究者選擇用 CHO 細(xì)胞作為抗體類藥物的瞬轉(zhuǎn)表達(dá)宿主。

  瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法有很多，現(xiàn)在最常用的方法為 PEI 轉(zhuǎn)染。選用轉(zhuǎn)染效率高的 PEI 很關(guān)鍵。使用 DOE 的方法確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度，質(zhì)粒和 PEI 的用量，確定質(zhì)粒和 PEI 孵育的時(shí)間。
 
轉(zhuǎn)染完成后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，添加 Enhancer 和補(bǔ)料，培養(yǎng)周期根據(jù)蛋白的累計(jì)效果及穩(wěn)定性來確定。培養(yǎng)結(jié)束后用 SEC-HPLC，Biacore 或者 Elisa 的方法檢測(cè)表達(dá)量。
 
  帶標(biāo)簽的蛋白可以通過親和填料純化得到目標(biāo)蛋白，不帶標(biāo)簽的可以通過離子交換，復(fù)合模式，或者疏水填料分離得到目標(biāo)蛋白。得到目標(biāo)蛋白后進(jìn)行質(zhì)量分析，通過 SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 初步分析蛋白的質(zhì)量。  
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染由于不需要質(zhì)粒穩(wěn)定整合到基因組形成細(xì)胞株，運(yùn)用這種方法能在短時(shí)間內(nèi)制備出蛋白樣品，用于蛋白功能和穩(wěn)定性的檢測(cè)。這一方法被廣泛運(yùn)用于藥物研發(fā)的早期階段。同時(shí)在威脅公共衛(wèi)生的突發(fā)傳染病的預(yù)防和治療方面可以在短期內(nèi)完成臨床前藥物開發(fā)，大大縮短藥物的研發(fā)周期。搭建高效的瞬轉(zhuǎn)平臺(tái)對(duì)項(xiàng)目的快速推進(jìn)影響深遠(yuǎn)。

 

---