Sapphire激光掃描系統(tǒng)磷屏成像在助力肺纖維化無創(chuàng)監(jiān)控新突破中的應(yīng)用
肺纖維化疾病由于缺乏可靠的生物標(biāo)志物進(jìn)行風(fēng)險分層和治療監(jiān)測，給疾病的精確管理帶來挑戰(zhàn)。近年來發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(MDMφ)的積累是促進(jìn)肺纖維化的關(guān)鍵因素。因此，跟蹤MDMφ積累的體內(nèi)動力學(xué)可望用于肺炎纖維化的評估。
近日，匹茲堡大學(xué)在Science Advances雜志（IF：13.6）發(fā)表了題為“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纖維化肺損傷模型中監(jiān)測MDMφ積累動力學(xué)的潛力，并確定了其作為纖維化肺疾病內(nèi)分型和預(yù)后生物標(biāo)志物的臨床相關(guān)性。
1 肺纖維化中的巨噬細(xì)胞圖景
為研究CMKLR1在IPF肺免疫細(xì)胞中的作用，作者對兩個具有>300,000個免疫細(xì)胞的全肺單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集進(jìn)行探索分析。按不同表型，巨噬細(xì)胞被分為包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬細(xì)胞，以及3組非肺泡巨噬細(xì)胞：SPP1- m φ組、FOLR2-Mφ組及罕見的OLFML3-Mφ群體。
2 CMKLR1表達(dá)標(biāo)志新生MDMφ的富集
兩個數(shù)據(jù)集中，CMKLR1表達(dá)在巨噬細(xì)胞群體中最常被檢測到(圖1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫細(xì)胞類型中具有最高的檢測頻率及CMKLR1表達(dá)，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
與更嚴(yán)重的下肺葉相比，IPF上肺葉中促纖維化SPP1+巨噬細(xì)胞更少。但CMKLR1+巨噬細(xì)胞數(shù)量在上、下肺葉中同樣具有顯著升高（IPF上肺葉：8.4%，下肺葉：8.9%；對照組上肺葉：2.3%，下肺葉：0.8%），相比于終末期SPP1+促纖維化巨噬細(xì)胞的升高，可作為更可靠的早期生物標(biāo)志物。
廣義加性模型(GAMs)顯示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ軌跡中，CMKLR1的表達(dá)隨著單核細(xì)胞特征的下降而上升，當(dāng)促纖維化基因表達(dá)開始時達(dá)到峰值，后隨著促纖維化特征的上升逐漸下降（圖1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纖維化中富集的標(biāo)志，可隨著巨噬細(xì)胞適應(yīng)纖維化微環(huán)境并逐漸下降。
圖1. 人類肺部疾病和健康的scRNA-seq分析。(B)按細(xì)胞類型標(biāo)記的細(xì)胞UMAP。(C-D) 細(xì)胞類型、數(shù)據(jù)集及疾病間標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)UMAP和熱圖。(I- J) 基因表達(dá)的廣義加性模型(GAM)擬合為上述每條軌跡的擴(kuò)散偽時間函數(shù)。
3 MDMφ驅(qū)動CMKLR1靶向肽的攝取
博萊霉素氣管給藥后的1、2和4周分別大致對應(yīng)于肺炎高峰期、持續(xù)肺炎的早期ECM重構(gòu)及炎癥消退伴纖維化。為便于流式細(xì)胞實驗，作者用熒光修飾肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示蹤劑[64Cu]NODAGA-CG34的類似物。結(jié)果顯示，基線期的主要免疫細(xì)胞群體為組織駐留的肺泡巨噬細(xì)胞，MDMφ忽略不計。1周后， MDMφ顯著積累，而肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。第2周，MDMφ數(shù)量與1周時相似，但后者數(shù)量大幅增加，且MDMφ表現(xiàn)出與其愈加相似的表型分化（圖2A）。4周后均回落至基線水平。在此期間，肺單核細(xì)胞數(shù)量相對穩(wěn)定。
圖2. 流式細(xì)胞術(shù)鑒定驅(qū)動CMKLR1靶向肽攝取的細(xì)胞。(A)肺泡巨噬細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞和MDMφ的鑒定。(B)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群絕對數(shù)量的動力學(xué)。(D)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群體對6CF- CG34特異性攝取的定量檢測。(E)給藥后攝取6CF- CG34的細(xì)胞亞群占比。
相應(yīng)地，最初2周的MDMφ對6CF-CG34的攝取很高，第4周趨于減少（圖2C、D）。間質(zhì)巨噬細(xì)胞僅在給藥后1周有短暫增加，2周后又恢復(fù)至基線水平。而肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在此期間均無顯著的6CF-CG34特異性攝取。NK細(xì)胞盡管具有顯著攝取，但博來霉素誘導(dǎo)損傷后，其豐度及CMKLR1表達(dá)均未變化。
此外，在損傷后1周和2周，6CF-CG34的總攝取顯著增加，且主要由MDMφ的積累驅(qū)動（78%和86%）。4周后降至基線水平，顯示了MDMφ豐度及其CMKLR1表達(dá)水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及體外γ計數(shù)均得到與上述的一致結(jié)果。
4 CMKLR1巨噬細(xì)胞浸潤的炎性肺區(qū)PET
為驗證[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬細(xì)胞浸潤的炎性肺組織空間圖的準(zhǔn)確性，作者隨后對肺部進(jìn)行磷屏成像（Sapphire激光掃描系統(tǒng)拍攝），并對CMKLR1和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80進(jìn)行免疫熒光染色(圖5)。體內(nèi)PET檢測的示蹤劑攝取與相應(yīng)的離體磷屏成像之間存在強(qiáng)大的共定位(圖5A、B)，證實了示蹤劑攝取的無創(chuàng)空間定位的準(zhǔn)確性。[64Cu]NODAGA-CG34攝取高的區(qū)域與表達(dá)CMKLR1的F4/80+巨噬細(xì)胞豐富的炎癥區(qū)域相對應(yīng)(圖5C、D)。可見，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量監(jiān)測博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化肺損傷各階段MDMφ募集的空間定位。
圖5. 博萊霉素處理小鼠1周后， CMKLR1巨噬細(xì)胞浸潤的炎性肺區(qū)[64Cu]NODAGA-CG34攝取共定位圖像(A) PET/CT(B)體外放射自顯影（磷屏成像，Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）(C)蘇木精和伊紅染色和(D)免疫染色組織
5 PET準(zhǔn)確預(yù)測肺纖維化程度
進(jìn)一步縱向研究顯示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高攝取的區(qū)域與第4周CT檢測到的嚴(yán)重纖維化的區(qū)域相對應(yīng)，且攝取量與纖維化程度（羥脯氨酸含量及肺衰減量）相關(guān)。而第1周的CT實變與纖維化程度僅為弱相關(guān)或不相關(guān)。可見，肺損傷早期[64Cu]NODAGA-CG34的攝取可準(zhǔn)確預(yù)測纖維化嚴(yán)重程度和分布，有效補(bǔ)充CT獲得的解剖學(xué)信息。
圖6. [64Cu]NODAGA-CG34 PET對早期肺纖維化的預(yù)測。肺部[64Cu]NODAGA-CG34攝取與第四周羥脯氨酸含量(C)及肺衰減 (D)相關(guān)。第1周的CT實變與第4周羥脯氨酸弱相關(guān)(E)，與肺衰減無顯著相關(guān)(F)。
6 CMKLR1有助識別IPF炎性內(nèi)型
對三個地點的IPF患者縱向隊列二次分析顯示，與對照組相比，IPF患者支氣管肺泡灌洗（BAL）細(xì)胞中的CMKLR1表達(dá)更高，且呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CMKLR1高表達(dá)患者中，趨化因子/趨化因子受體（如CCL2、CCL7）、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)（圖7B），或可助于識別IFP不同炎癥內(nèi)型。
CMKLR1表達(dá)具有作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，與年齡、性別、研究地點和GAP（性別-年齡生理學(xué)）指數(shù)無關(guān)。CMKLR1表達(dá)越高，預(yù)后逐漸惡化。
此外，在不同水平GAP指數(shù)的患者分層中，CMKLR1表達(dá)均顯示與生存率的相關(guān)性。ROC分析顯示，CMKLR1在短期至中期隨訪期間的預(yù)測能力優(yōu)于GAP評分，可望提供現(xiàn)有臨床工具外更豐富的風(fēng)險分層信息。
圖7. CMKLR1高表達(dá)可識別炎癥性和預(yù)后不良的IPF內(nèi)型。(D)基于CMKLR1表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線。(E、F) GAP評分分層后的Kaplan-Meier生存曲線表明，CMKLR1高表達(dá)預(yù)示著較差的生存。(G、H) CMKLR1表達(dá)及GAP評分預(yù)測BAL術(shù)后死亡率的ROC曲線。
7 CMKLR1在各類纖維化肺病中的表達(dá)
作者利用現(xiàn)有的生物庫進(jìn)一步探索分析，發(fā)現(xiàn)IPF、結(jié)節(jié)病、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和煤礦工人塵肺患者肺中存在表達(dá)CMKLR1的白細(xì)胞，提供了CMKLR1在各種纖維化肺疾病中表達(dá)的組織學(xué)證據(jù)。但由于移除的肺通常代表終末期的疾病特征，仍需進(jìn)一步研究來闡明CMKLR1在這些疾病中的特異性表達(dá)，及其用于疾病內(nèi)分型和風(fēng)險分層的潛在用途。
8 總結(jié)與討論
本研究建立了CMKLR1作為纖維化肺病中富集MDMφ的生物標(biāo)志物，證明了CMKLR1靶向PET無創(chuàng)監(jiān)測MDMφ積累和纖維化程度預(yù)測的準(zhǔn)確性，并顯示出其對IPF分子內(nèi)分型的應(yīng)用前景。
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
近日，匹茲堡大學(xué)在Science Advances雜志（IF：13.6）發(fā)表了題為“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纖維化肺損傷模型中監(jiān)測MDMφ積累動力學(xué)的潛力，并確定了其作為纖維化肺疾病內(nèi)分型和預(yù)后生物標(biāo)志物的臨床相關(guān)性。
1 肺纖維化中的巨噬細(xì)胞圖景
為研究CMKLR1在IPF肺免疫細(xì)胞中的作用，作者對兩個具有>300,000個免疫細(xì)胞的全肺單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集進(jìn)行探索分析。按不同表型，巨噬細(xì)胞被分為包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬細(xì)胞，以及3組非肺泡巨噬細(xì)胞：SPP1- m φ組、FOLR2-Mφ組及罕見的OLFML3-Mφ群體。
2 CMKLR1表達(dá)標(biāo)志新生MDMφ的富集
兩個數(shù)據(jù)集中，CMKLR1表達(dá)在巨噬細(xì)胞群體中最常被檢測到(圖1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫細(xì)胞類型中具有最高的檢測頻率及CMKLR1表達(dá)，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
與更嚴(yán)重的下肺葉相比，IPF上肺葉中促纖維化SPP1+巨噬細(xì)胞更少。但CMKLR1+巨噬細(xì)胞數(shù)量在上、下肺葉中同樣具有顯著升高（IPF上肺葉：8.4%，下肺葉：8.9%；對照組上肺葉：2.3%，下肺葉：0.8%），相比于終末期SPP1+促纖維化巨噬細(xì)胞的升高，可作為更可靠的早期生物標(biāo)志物。
廣義加性模型(GAMs)顯示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ軌跡中，CMKLR1的表達(dá)隨著單核細(xì)胞特征的下降而上升，當(dāng)促纖維化基因表達(dá)開始時達(dá)到峰值，后隨著促纖維化特征的上升逐漸下降（圖1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纖維化中富集的標(biāo)志，可隨著巨噬細(xì)胞適應(yīng)纖維化微環(huán)境并逐漸下降。
3 MDMφ驅(qū)動CMKLR1靶向肽的攝取
博萊霉素氣管給藥后的1、2和4周分別大致對應(yīng)于肺炎高峰期、持續(xù)肺炎的早期ECM重構(gòu)及炎癥消退伴纖維化。為便于流式細(xì)胞實驗，作者用熒光修飾肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示蹤劑[64Cu]NODAGA-CG34的類似物。結(jié)果顯示，基線期的主要免疫細(xì)胞群體為組織駐留的肺泡巨噬細(xì)胞，MDMφ忽略不計。1周后， MDMφ顯著積累，而肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。第2周，MDMφ數(shù)量與1周時相似，但后者數(shù)量大幅增加，且MDMφ表現(xiàn)出與其愈加相似的表型分化（圖2A）。4周后均回落至基線水平。在此期間，肺單核細(xì)胞數(shù)量相對穩(wěn)定。
相應(yīng)地，最初2周的MDMφ對6CF-CG34的攝取很高，第4周趨于減少（圖2C、D）。間質(zhì)巨噬細(xì)胞僅在給藥后1周有短暫增加，2周后又恢復(fù)至基線水平。而肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在此期間均無顯著的6CF-CG34特異性攝取。NK細(xì)胞盡管具有顯著攝取，但博來霉素誘導(dǎo)損傷后，其豐度及CMKLR1表達(dá)均未變化。
此外，在損傷后1周和2周，6CF-CG34的總攝取顯著增加，且主要由MDMφ的積累驅(qū)動（78%和86%）。4周后降至基線水平，顯示了MDMφ豐度及其CMKLR1表達(dá)水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及體外γ計數(shù)均得到與上述的一致結(jié)果。
4 CMKLR1巨噬細(xì)胞浸潤的炎性肺區(qū)PET
為驗證[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬細(xì)胞浸潤的炎性肺組織空間圖的準(zhǔn)確性，作者隨后對肺部進(jìn)行磷屏成像（Sapphire激光掃描系統(tǒng)拍攝），并對CMKLR1和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80進(jìn)行免疫熒光染色(圖5)。體內(nèi)PET檢測的示蹤劑攝取與相應(yīng)的離體磷屏成像之間存在強(qiáng)大的共定位(圖5A、B)，證實了示蹤劑攝取的無創(chuàng)空間定位的準(zhǔn)確性。[64Cu]NODAGA-CG34攝取高的區(qū)域與表達(dá)CMKLR1的F4/80+巨噬細(xì)胞豐富的炎癥區(qū)域相對應(yīng)(圖5C、D)。可見，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量監(jiān)測博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化肺損傷各階段MDMφ募集的空間定位。
5 PET準(zhǔn)確預(yù)測肺纖維化程度
進(jìn)一步縱向研究顯示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高攝取的區(qū)域與第4周CT檢測到的嚴(yán)重纖維化的區(qū)域相對應(yīng)，且攝取量與纖維化程度（羥脯氨酸含量及肺衰減量）相關(guān)。而第1周的CT實變與纖維化程度僅為弱相關(guān)或不相關(guān)。可見，肺損傷早期[64Cu]NODAGA-CG34的攝取可準(zhǔn)確預(yù)測纖維化嚴(yán)重程度和分布，有效補(bǔ)充CT獲得的解剖學(xué)信息。
6 CMKLR1有助識別IPF炎性內(nèi)型
對三個地點的IPF患者縱向隊列二次分析顯示，與對照組相比，IPF患者支氣管肺泡灌洗（BAL）細(xì)胞中的CMKLR1表達(dá)更高，且呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CMKLR1高表達(dá)患者中，趨化因子/趨化因子受體（如CCL2、CCL7）、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)（圖7B），或可助于識別IFP不同炎癥內(nèi)型。
CMKLR1表達(dá)具有作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，與年齡、性別、研究地點和GAP（性別-年齡生理學(xué)）指數(shù)無關(guān)。CMKLR1表達(dá)越高，預(yù)后逐漸惡化。
此外，在不同水平GAP指數(shù)的患者分層中，CMKLR1表達(dá)均顯示與生存率的相關(guān)性。ROC分析顯示，CMKLR1在短期至中期隨訪期間的預(yù)測能力優(yōu)于GAP評分，可望提供現(xiàn)有臨床工具外更豐富的風(fēng)險分層信息。
7 CMKLR1在各類纖維化肺病中的表達(dá)
作者利用現(xiàn)有的生物庫進(jìn)一步探索分析，發(fā)現(xiàn)IPF、結(jié)節(jié)病、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和煤礦工人塵肺患者肺中存在表達(dá)CMKLR1的白細(xì)胞，提供了CMKLR1在各種纖維化肺疾病中表達(dá)的組織學(xué)證據(jù)。但由于移除的肺通常代表終末期的疾病特征，仍需進(jìn)一步研究來闡明CMKLR1在這些疾病中的特異性表達(dá)，及其用于疾病內(nèi)分型和風(fēng)險分層的潛在用途。
8 總結(jié)與討論
本研究建立了CMKLR1作為纖維化肺病中富集MDMφ的生物標(biāo)志物，證明了CMKLR1靶向PET無創(chuàng)監(jiān)測MDMφ積累和纖維化程度預(yù)測的準(zhǔn)確性，并顯示出其對IPF分子內(nèi)分型的應(yīng)用前景。
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https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
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