抗體滴度對(duì)納米流式分析細(xì)胞外囊泡結(jié)果的重要影響研究詳解

瀏覽次數(shù)：658　發(fā)布日期：2024-7-3　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

本研發(fā)現(xiàn)納米流式儀在細(xì)胞外囊泡(EV)分析時(shí)抗體滴定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是很重要的，可以確保在EV群體中使用最佳濃度的抗體來量化其抗原標(biāo)志物，并產(chǎn)生準(zhǔn)確和可重復(fù)的結(jié)果。使用濃度不足的熒光抗體不能充分染色EV抗原位點(diǎn)，導(dǎo)致高于基線的熒光信號(hào)檢測(cè)不理想。相反，抗體濃度過高可導(dǎo)致抗體上熒光標(biāo)記的潛在聚集、非特異性結(jié)合或背景信號(hào)增加。這些情況會(huì)阻礙微弱的陽性信號(hào)的檢測(cè)，使準(zhǔn)確性受到影響。

加拿大科研人員研究發(fā)現(xiàn)抗體滴度對(duì)納米流式分析細(xì)胞外囊泡結(jié)果的重要影響研究。本研究使用Apogee A60 Microplus對(duì)血小板作為細(xì)胞替代品和血小板衍生顆粒作為EV群體的替代品，展示了抗體滴定過程，突出了一些關(guān)鍵的分析參數(shù)，這些參數(shù)可能會(huì)使進(jìn)入EV研究領(lǐng)域的新研究人員感到困惑和驚訝，證明了納米流式儀和抗體滴度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要影響。

所有樣品均使用Apogee A60 MicroPlus平臺(tái)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了儀器的靈敏度和分辨率方面的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別用散點(diǎn)圖和峰形圖來展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且說明每個(gè)圖的具體樣品。(A-D)用于進(jìn)一步評(píng)估平臺(tái)的成熟度，并提供可識(shí)別的尺寸參考范圍(80 nm聚苯乙/烯- 1300 nm二氧化硅)。(E-G)說明真實(shí)珠01 A，B和有機(jī)硅珠的分辨率。(H)在沒有樣品、抗體、膜染色劑和洗滌劑的情況下，顯示儀器和稀釋劑的清潔度。(I-L)血漿樣品的散點(diǎn)圖。(I)血漿中加入抗體CD41a-APC散點(diǎn)圖 (J)，血漿，抗體和添加CFDA-SE膜染料散點(diǎn)圖(K)，血漿，抗體散點(diǎn)圖(L) CFDA-SE膜染料和Triton X-100洗滌劑散點(diǎn)圖。

(Fig.4)

血漿是最廣泛用于疾病生物標(biāo)志物評(píng)估的液體活檢之一。圖5展示了Apogee A60 Micro plus 在血漿樣本的數(shù)據(jù)。從結(jié)果可以看出CD41a陽性表位的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，從上到下是五種不同偶聯(lián)CD41a抗體，抗體濃度從左到右增加的結(jié)果。對(duì)于每個(gè)偶聯(lián)物，在每個(gè)散點(diǎn)圖的右上角檢測(cè)到一個(gè)獨(dú)特的完整血小板群。隨著抗體濃度增加在基線上方明顯出現(xiàn)第二群CD41a陽性pdp (散點(diǎn)圖中心)。通常用微流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)許多抗體的非特異性結(jié)合，CD41a-SuperBright436滴定的上顯示了這樣一個(gè)群體(藍(lán)色圓圈)。不同的熒光偶聯(lián)抗體由高到低依次為405 nm激發(fā)(eFluor450、SuperBright436)、488 nm激發(fā)(FITC)、561 nm激發(fā)(PE)和638 nm激發(fā)(APC)（Fig.5）。

（Fig.5）

比較不同熒光偶聯(lián)物在最佳抗體濃度下對(duì)(A)陽性染色血小板和(B) pdp的檢測(cè)。不同偶聯(lián)抗體的完整血小板檢測(cè)濃度相似，但pdp檢測(cè)濃度隨著熒光團(tuán)相對(duì)亮度的增加而明顯增加。當(dāng)使用最佳抗體濃度時(shí)，無論選擇何種偶聯(lián)物，檢測(cè)到的完整血小板的濃度都是相似的。相比之下，pdp的檢測(cè)濃度隨著偶聯(lián)抗體亮度的增加而顯著增加。每個(gè)歐聯(lián)抗體的相對(duì)亮度提供了將離散的陽性信號(hào)移動(dòng)到“噪音”或陰性背景閾值之上的能力，并被計(jì)算為一個(gè)“事件”。隨著EV尺寸的減小，潛在可用抗原的比例減少，因此信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度也相應(yīng)降低。因此，當(dāng)粒子群變小時(shí)，粒子本身或探測(cè)表面抗原的信號(hào)強(qiáng)度最終會(huì)合并到負(fù)的粒子群中。這也意味著更亮的偶聯(lián)物可以使更大比例的小粒子越過檢測(cè)閾值。此外，歐聯(lián)物的大小可以給粒子增加顯著的粒徑測(cè)量值，從而增加粒子穿越儀器的光散射檢測(cè)閾值的能力。

結(jié)論：由于各種技術(shù)原因，用于分析EV表面抗原的抗體滴定具有挑戰(zhàn)性。必須非常小心地確保儀器和試劑在合理范圍利用。完整分析MFI、濃度、分離或染色指數(shù)數(shù)據(jù)是非常有益的，而簡單地將相同的細(xì)胞分析程序轉(zhuǎn)換為EV分析可能會(huì)導(dǎo)致重大問題。使用標(biāo)準(zhǔn)化的方案來定義實(shí)驗(yàn)的最佳抗體濃度將會(huì)提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒（如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP）等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè) （如免疫細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！