Azure多功能分子成像系統(tǒng)助力揭示一種新型抗生素磷脂糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制
革蘭氏陰性菌中富含脂多糖（LPS）的外膜結(jié)構(gòu)對(duì)維持細(xì)胞活力至關(guān)重要，破壞外膜會(huì)增加其抗生素敏感性。外膜組裝過程中，LPS需穿過周質(zhì)空間從內(nèi)膜運(yùn)輸至細(xì)胞表面。此過程依賴于內(nèi)膜上的脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LptB2FGC，通過水解ATP，將LPS傳遞給由LptF、LptC、可溶性周質(zhì)蛋白LptA及整合膜蛋白LptD的周質(zhì)部分形成的蛋白質(zhì)橋進(jìn)行運(yùn)輸。最近發(fā)現(xiàn)的大環(huán)肽家族被認(rèn)為可抑制脂多糖轉(zhuǎn)運(yùn)，且生化實(shí)驗(yàn)顯示出對(duì)不動(dòng)桿菌的抗性，但仍缺少結(jié)構(gòu)信息以確定這些抗生素抑制LPS轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。
近日，哈佛大學(xué)在Nature雜志發(fā)表了題為“A new antibiotic traps lipopolysaccharide in its intermembrane transporter”的文章，解析了LptB2FGC復(fù)合物結(jié)合大環(huán)肽的結(jié)構(gòu)，明確了LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制，從而為下一代抗生素的開發(fā)和應(yīng)用繪制了藍(lán)圖。
1 藥物與LPS的結(jié)合及結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡下，大環(huán)肽化合物1與LptB2FG和結(jié)合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達(dá)及A. baylyi 菌株表達(dá)的LptB2FGC復(fù)合物在LPS存在下結(jié)合大環(huán)肽化合物1的結(jié)構(gòu)（圖1d），呈現(xiàn)出高度一致性。
圖1c、不動(dòng)桿菌LptB2FG復(fù)合物與LPS、化合物1結(jié)合的內(nèi)膜冷凍電鏡結(jié)構(gòu)d，轉(zhuǎn)運(yùn)體腔中不動(dòng)桿菌LptB2FG與不動(dòng)桿菌LPS、化合物1結(jié)合的冷凍電鏡圖（白色），與大腸桿菌LPS和1結(jié)合不動(dòng)桿菌LptB2FG的結(jié)構(gòu)疊加。
大環(huán)肽化合物的結(jié)合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關(guān)鍵殘基的突變會(huì)不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時(shí)，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），監(jiān)測(cè)LPS從LptB2FGC復(fù)合物釋放向LPtA的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復(fù)合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實(shí)了大環(huán)肽-LptFG接觸對(duì)抑制不動(dòng)桿菌菌株生長(zhǎng)的重要性。
圖2. 轉(zhuǎn)運(yùn)體中化合物1與LPS結(jié)合的中間態(tài)。a，LptF與LPS及化合物1的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖， c,d, 化合物1可抑制野生型LptB2FGC向LptA轉(zhuǎn)運(yùn)LPS(c)，但對(duì)LptB2FE249KGC或LptB2FI317NGC 無效(d)（Azure多功能分子成像系統(tǒng)拍攝）。e，轉(zhuǎn)運(yùn)體腔中LptB2FG結(jié)合LPS（白色）與LptB2FG-LPS-1結(jié)構(gòu)的疊加圖。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其整體構(gòu)象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時(shí)相同(圖2e)。表明該狀態(tài)可作為抗生素開發(fā)的藥物作用構(gòu)象。此外，LptF Arg30和Arg55對(duì)不動(dòng)桿菌中復(fù)合物的功能至關(guān)重要，可能有助于在運(yùn)輸過程中定位LPS。
作者隨后構(gòu)建了LPS的LpxM缺失突變體，探究不動(dòng)桿菌LPS的結(jié)構(gòu)改變對(duì)化合物1抑制效力的影響。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），當(dāng)化合物1濃度達(dá)到抑制野生型LPS運(yùn)輸所需濃度的20倍時(shí)，從大腸桿菌ΔlpxM分離的LPS的運(yùn)輸是可能的(圖3b)。不動(dòng)桿菌ΔLpxM LPS對(duì)化合物1的易感性比野生型低30倍 ，與此結(jié)果一致。由于ΔLpxM菌株毒力較低，因此lpxM缺失可能不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)大環(huán)肽的易感性降低。
圖3. 化合物1對(duì)野生型及ΔLpxM菌株的LPS轉(zhuǎn)運(yùn)抑制情況。ΔLpxM菌株中分離的LPS使LptB2FGC對(duì)1具有抗性。
3 LptC螺旋與藥物的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)
LptC螺旋是協(xié)調(diào)LPS運(yùn)輸與ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1結(jié)構(gòu)顯示，LPS轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，化合物1與LptC TM螺旋具有結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。這解釋了化合物3的殺菌效力相當(dāng)，但其抑制LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS的有效性大不如1和2的原因。
冷凍電鏡顯示，化合物1和2含有相對(duì)較大的取代基，可比化合物3更有效地與LptC TM螺旋競(jìng)爭(zhēng)。由此推斷，LptC TM螺旋缺失時(shí)，化合物1、2、3均應(yīng)抑制LPS的釋放。作者隨后在體外構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像）進(jìn)行驗(yàn)證。與預(yù)測(cè)一致，化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉(zhuǎn)運(yùn)，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C對(duì)LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有同等效力(圖4d)。
圖4d, 化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉(zhuǎn)運(yùn)，但1、2和3在體外抑制LptB2FG-ΔTM-C對(duì)LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)。e, 化合物 1以LPS依賴的方式增加LptB2FG、LptB2FGC和LptB2FG-ΔTM-C的ATP酶活性。f, SPA測(cè)量顯示化合物2在LPS存在而LptC不存在的情況下與Lpt結(jié)合。
4 藥物將ATP酶活性與LPS轉(zhuǎn)運(yùn)分離
LptB2FG轉(zhuǎn)運(yùn)體中的LPS裝載可刺激ATP酶活性。由于大環(huán)肽在轉(zhuǎn)運(yùn)體中捕獲LPS，因此將化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC復(fù)合物中時(shí)，均導(dǎo)致ATP酶活大幅增加(圖4e) 。可見，化合物與LptB2FG的結(jié)合是大環(huán)肽發(fā)揮活性的關(guān)鍵。臨近閃爍分析(SPA)驗(yàn)證了上述結(jié)論，且再次驗(yàn)證了1-3均有相當(dāng)?shù)臍⒕ЯΓ约按蟓h(huán)肽靶與LptC TM螺旋競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的作用機(jī)制。
5 總結(jié)與討論
總的來說，本研究揭示了大環(huán)肽家族的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制，揭示了Lpt轉(zhuǎn)運(yùn)體的可藥物構(gòu)象，并為這類抗生素?cái)U(kuò)展到其他革蘭氏陰性病原體的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7
創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)性能，Azure多功能分子成像系統(tǒng)廣泛兼具普通凝膠、化學(xué)發(fā)光、RGB和激光NIR熒光成像等功能應(yīng)用。更靈活具有多種型號(hào)，可按需選擇，后續(xù)可擴(kuò)展升級(jí)。獨(dú)創(chuàng)配備的雙近紅外激光光源，可獲取高信號(hào)、低背景的高靈敏度信號(hào)，成就非凡生物成像體驗(yàn)！
關(guān)注我們，解鎖更多Western Blot新技能，放飛科研無限想象！
近日，哈佛大學(xué)在Nature雜志發(fā)表了題為“A new antibiotic traps lipopolysaccharide in its intermembrane transporter”的文章，解析了LptB2FGC復(fù)合物結(jié)合大環(huán)肽的結(jié)構(gòu)，明確了LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制，從而為下一代抗生素的開發(fā)和應(yīng)用繪制了藍(lán)圖。
1 藥物與LPS的結(jié)合及結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡下，大環(huán)肽化合物1與LptB2FG和結(jié)合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達(dá)及A. baylyi 菌株表達(dá)的LptB2FGC復(fù)合物在LPS存在下結(jié)合大環(huán)肽化合物1的結(jié)構(gòu)（圖1d），呈現(xiàn)出高度一致性。
大環(huán)肽化合物的結(jié)合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關(guān)鍵殘基的突變會(huì)不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時(shí)，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），監(jiān)測(cè)LPS從LptB2FGC復(fù)合物釋放向LPtA的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復(fù)合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實(shí)了大環(huán)肽-LptFG接觸對(duì)抑制不動(dòng)桿菌菌株生長(zhǎng)的重要性。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其整體構(gòu)象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時(shí)相同(圖2e)。表明該狀態(tài)可作為抗生素開發(fā)的藥物作用構(gòu)象。此外，LptF Arg30和Arg55對(duì)不動(dòng)桿菌中復(fù)合物的功能至關(guān)重要，可能有助于在運(yùn)輸過程中定位LPS。
作者隨后構(gòu)建了LPS的LpxM缺失突變體，探究不動(dòng)桿菌LPS的結(jié)構(gòu)改變對(duì)化合物1抑制效力的影響。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），當(dāng)化合物1濃度達(dá)到抑制野生型LPS運(yùn)輸所需濃度的20倍時(shí)，從大腸桿菌ΔlpxM分離的LPS的運(yùn)輸是可能的(圖3b)。不動(dòng)桿菌ΔLpxM LPS對(duì)化合物1的易感性比野生型低30倍 ，與此結(jié)果一致。由于ΔLpxM菌株毒力較低，因此lpxM缺失可能不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)大環(huán)肽的易感性降低。
3 LptC螺旋與藥物的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)
LptC螺旋是協(xié)調(diào)LPS運(yùn)輸與ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1結(jié)構(gòu)顯示，LPS轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，化合物1與LptC TM螺旋具有結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。這解釋了化合物3的殺菌效力相當(dāng)，但其抑制LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS的有效性大不如1和2的原因。
冷凍電鏡顯示，化合物1和2含有相對(duì)較大的取代基，可比化合物3更有效地與LptC TM螺旋競(jìng)爭(zhēng)。由此推斷，LptC TM螺旋缺失時(shí)，化合物1、2、3均應(yīng)抑制LPS的釋放。作者隨后在體外構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像）進(jìn)行驗(yàn)證。與預(yù)測(cè)一致，化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉(zhuǎn)運(yùn)，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C對(duì)LPS的轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有同等效力(圖4d)。
4 藥物將ATP酶活性與LPS轉(zhuǎn)運(yùn)分離
LptB2FG轉(zhuǎn)運(yùn)體中的LPS裝載可刺激ATP酶活性。由于大環(huán)肽在轉(zhuǎn)運(yùn)體中捕獲LPS，因此將化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC復(fù)合物中時(shí)，均導(dǎo)致ATP酶活大幅增加(圖4e) 。可見，化合物與LptB2FG的結(jié)合是大環(huán)肽發(fā)揮活性的關(guān)鍵。臨近閃爍分析(SPA)驗(yàn)證了上述結(jié)論，且再次驗(yàn)證了1-3均有相當(dāng)?shù)臍⒕ЯΓ约按蟓h(huán)肽靶與LptC TM螺旋競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的作用機(jī)制。
5 總結(jié)與討論
總的來說，本研究揭示了大環(huán)肽家族的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制，揭示了Lpt轉(zhuǎn)運(yùn)體的可藥物構(gòu)象，并為這類抗生素?cái)U(kuò)展到其他革蘭氏陰性病原體的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7
創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)性能，Azure多功能分子成像系統(tǒng)廣泛兼具普通凝膠、化學(xué)發(fā)光、RGB和激光NIR熒光成像等功能應(yīng)用。更靈活具有多種型號(hào)，可按需選擇，后續(xù)可擴(kuò)展升級(jí)。獨(dú)創(chuàng)配備的雙近紅外激光光源，可獲取高信號(hào)、低背景的高靈敏度信號(hào)，成就非凡生物成像體驗(yàn)！
關(guān)注我們，解鎖更多Western Blot新技能，放飛科研無限想象！
- 適配蛋白質(zhì)印跡成像的CCD相機(jī)選型詳解
- Sapphire激光掃描系統(tǒng)磷屏成像在助力肺纖維化無創(chuàng)監(jiān)控新突破中的應(yīng)用
- Azure多功能分子成像系統(tǒng)助力揭示一種新型抗生素磷脂糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制機(jī)制
- 使用Sapphire FL對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行多重?zé)晒釯HC成像的實(shí)驗(yàn)過程介紹
- Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)在HeLa細(xì)胞的STAT3/pSTAT3測(cè)定中的應(yīng)用
- 文獻(xiàn)速遞：一種快速的PROTAC新藥篩選方法及在乳腺癌治療中的應(yīng)用
- Azure Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)在揭示突觸多樣性的蛋白圖譜中的應(yīng)用
- Sapphire激光掃描成像在Cas13激活新機(jī)制可優(yōu)化腺相關(guān)病毒治療中應(yīng)用
- 新品：Syngene化學(xué)發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)G:Box mini
- 祝賀Bio-Gene成為Syngene中國(guó)官方代理
- Azure Biosystems榮獲2024“科學(xué)家選擇獎(jiǎng)” 提名
- 第十六屆中國(guó)在線分析儀器應(yīng)用及發(fā)展論壇日程表
- 講座回顧:RePlex技術(shù)簡(jiǎn)化您的Western Blot流程
- 2021第19屆生化分析與實(shí)驗(yàn)室建設(shè)管理論壇二輪通知
- 第四屆中國(guó)醫(yī)療產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新與發(fā)展大會(huì)亮點(diǎn)紛呈
- “以初心 拓未來”Cytiva一周年慶典活動(dòng)正式開啟
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com