溶液外觀對(duì)注射用的原料來說是必檢項(xiàng)目，其通常包括液體的透明度、濁度和顏色。在生物制劑制造過程中，由于培養(yǎng)基及金屬工藝設(shè)備的接觸，使得色素存在于蛋白質(zhì)中間體和最終樣品原液中，這在高濃度蛋白溶液中尤為顯著。

蛋白溶液的外觀在產(chǎn)品放行檢測(cè)時(shí)是一個(gè)重要的質(zhì)量參數(shù)�！稓W洲藥典》對(duì)人用單克隆抗體顏色做出了要求，即人用單克隆抗體的液體制劑是“透明或略帶乳白色，無(wú)色或略帶顏色的液體”^[1]。這也是國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH) Q6B放行規(guī)范中規(guī)定的檢測(cè)項(xiàng)。顏色異常意味著產(chǎn)品可能被污染或已降解，所以色素的控制和去除是蛋白生產(chǎn)過程中非常重要的環(huán)節(jié)。提前了解色素的控制和去除方法對(duì)于新藥或仿制藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草和申報(bào)都非常有幫助。

色素的來源
影響蛋白溶液顏色且難以去除的色素主要是由培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)和收獲過程中與蛋白分子結(jié)合或?qū)е碌鞍追肿幼冃詴r(shí)產(chǎn)生的。對(duì)顏色影響最大的是維生素B和鐵離子，比如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的常添加的CN-B12在光照條件下轉(zhuǎn)化為OH-B12之后與抗體分子結(jié)合導(dǎo)致粉色^[2]；鐵離子濃度會(huì)增加蛋白藥物原液的顏色和酸性變異體。
鐵離子不會(huì)直接引起蛋白原液的變化，會(huì)因芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（ROS），使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的色氨酸氧化成N-甲酰犬尿氨酸(淺黃色)和犬尿氨酸(棕黃色)^[3,5]。
細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的幾種高級(jí)糖化終產(chǎn)物(AGE)是有顏色(黃褐色)和熒光的。AGE的結(jié)構(gòu)及其形成途徑復(fù)雜多樣，但都源于還原糖或碳水化合物氧化降解的二羰基副產(chǎn)物與蛋白質(zhì)賴氨酸或精氨酸的氨基側(cè)鏈反應(yīng)[3]。
畢赤酵母誘導(dǎo)中后期，AOX1醇氧化酶釋放進(jìn)入發(fā)酵液，結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔因子形成八聚物導(dǎo)致綠色^[4]。
另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能會(huì)引入顏色。

蛋白溶液顏色的控制
在蛋白生產(chǎn)過程中，細(xì)胞株構(gòu)建、上游培養(yǎng)、層析純化這三個(gè)階段都能對(duì)色素進(jìn)行有效的控制和去除。尤其在純化階段，層析介質(zhì)可以有效去除樣品中的多種色素。

細(xì)胞株構(gòu)建階段
不同的細(xì)胞株對(duì)鐵離子和維生素B12的吸收和需求量有所不同，如果選擇對(duì)鐵離子和維生素B12消耗速率快或含量要求低的細(xì)胞株，使其培養(yǎng)液中的鐵離子和維生素B12含量降低，產(chǎn)生異常顏色的概率會(huì)降低。

上游培養(yǎng)階段
適當(dāng)優(yōu)化培養(yǎng)基的組分，比如抗體生產(chǎn)中可以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基中的高氧化性組分（如鐵離子）和光敏感性成分（如B族維生素等）的含量。

在細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中，通過優(yōu)化金屬離子或者其它添加劑的含量，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白顯色，建議嘗試不同類型的培養(yǎng)基，適當(dāng)減少這些成分的用量，并通過篩選高產(chǎn)細(xì)胞株或長(zhǎng)期傳代馴化，保證產(chǎn)量。

層析純化階段
色素的種類特別多，大分子、小分子的，帶正、負(fù)電荷的，疏水、親水的等。層析純化適用于去除一些與蛋白質(zhì)不結(jié)合或者非共價(jià)結(jié)合的色素去除，對(duì)于一些與蛋白共價(jià)結(jié)合的色素（如OH-B12與半胱氨酸殘基的結(jié)合），則需要優(yōu)化培養(yǎng)條件，在上游培養(yǎng)階段進(jìn)行控制。如果不清楚溶液中色素的性質(zhì)，可以嘗試不同的層析方法。

• 親和層析
親和層析多為蛋白純化捕獲階段，通過優(yōu)化緩沖液體系以破壞色素與填料之間的離子型吸附及非特異性吸附，在對(duì)蛋白進(jìn)行富集的同時(shí)可有效去除色素。
• 離子交換層析
中性條件下多數(shù)色素帶負(fù)電荷，陰離子流穿模式時(shí)色素與填料結(jié)合，通過高鹽或堿液洗脫。或蛋白結(jié)合陽(yáng)離子填料，色素流穿。該階段的重點(diǎn)在于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，找到合適的上樣條件是去除色素的關(guān)鍵。
• 疏水作用層析
色素也具有一定的疏水性質(zhì)，因此可以利用色素與目的蛋白表面疏水性的差異，通過優(yōu)化填料的種類、鹽的類型和濃度、選擇不同的鹽濃度梯度洗脫的方式來去除色素。
• 凝膠過濾層析
如果色素與目的蛋白分子量上有明顯差異，可使用凝膠過濾進(jìn)行去除，例如通過脫鹽柱進(jìn)行緩沖液置換及精純階段高分辨分子篩除雜時(shí)，色素在一定程度上可被去除或被吸附。

案例分享：動(dòng)物源體外分泌酶中色素的去除
本案例使用Diamond MMC Mustang填料通過DoE方法開發(fā)出的動(dòng)物源體外分泌酶的純化工藝，可以很好地將料液中的黃色色素去除掉。從下圖中可以明顯看出，洗脫液基本接近無(wú)色，色素去除效果很好。

左：原樣；中：清洗液；右：洗脫液

Diamond MMC Mustang填料是一款高剛性的弱陽(yáng)離子+疏水的復(fù)合模式填料，由于兼具離子、疏水、氫鍵、范德華力等多種作用力，使其對(duì)多種類型的色素都有較好的去除效果。

層析介質(zhì)上色素的去除
色素性質(zhì)復(fù)雜，可根據(jù)填料的耐受情況制定CIP方案。NaOH是最常用的清潔試劑。除此之外，高鹽、有機(jī)試劑（20%乙醇或30%異丙醇）、尿素、鹽酸胍或酸也是常見的清洗方案。也可通過混合試劑或其他針對(duì)性清洗方法對(duì)填料進(jìn)行處理，如已知色素種類，可根據(jù)色素的性質(zhì)采用特定的方法進(jìn)行清洗。

鐵離子殘留帶來的黃褐色去除
黃褐色主要源于鐵離子與NaOH反應(yīng)生成的氫氧化鐵沉淀，可以嘗試使用酸進(jìn)行清洗，例如使用0.5M磷酸靜態(tài)處理10~15min。處理時(shí)間不宜過長(zhǎng)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致鐵離子重新結(jié)合^[5]。
維生素B12引起的粉色去除
可以使用組氨酸或咪唑等電子供體取代OH-B12中的OH自由基，例如使用0.3M組氨酸+0.5M NaCl，pH4.0的緩沖液處理5~10CV。
疏水作用力結(jié)合的色素去除
使用高濃度的堿溶液破壞蛋白結(jié)構(gòu)，破壞疏水作用力，例如使用0.5~1M NaOH處理3~5CV。
脂類色素
根據(jù)相似相溶原理可以用0.5M 非離子去污劑、70%乙醇、30%異丙醇處理3~5CV。
沉積的頑固色素
可以采用多種試劑混合進(jìn)行處理，例如使用0.5M醋酸+8M尿素+1~2M NaCl或1M NaOH+2M NaCl處理5~10CV。在可以耐受有機(jī)溶劑時(shí)，還可使用1M NaOH+30%異丙醇的方式進(jìn)行清洗。
隨著介質(zhì)使用次數(shù)的增加，積累的色素仍可能會(huì)導(dǎo)致填料外觀顏色變深、載量下降，嚴(yán)重時(shí)柱內(nèi)填料塌陷、板結(jié)，影響填料性能與壽命，必要時(shí)可以去掉部分色素污染嚴(yán)重的填料。

總結(jié)
色素的種類多樣，雖然層析純化是去除色素最有效的方法之一，但是填料的性能也受色素影響，因此對(duì)料液預(yù)處理階段的過濾與澄清，可以很大程度上緩解后續(xù)純化的壓力、延長(zhǎng)填料的使用壽命。

參考資料
[1] European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg,France, Edition 7.5; 2012.
[2] Kenneth M Prentice, et al. Hydroxocobalamin association during cell culture results in pink therapeutic proteins [J]. mAbs, 5:6, 974-981, 2013.
[3] Margaret Butko, et al. Recombinant Antibody Color Resulting from Advanced Glycation End Product Modifications [J]. Analytical Chemistry, 86(19): 9816-9823, 2014.
[4] L. M. Damasceno, et al. An optimized fermentation process for high-level production of a single-chain Fv antibody fragment in Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Purification, 37:18-26, 2004.
[5] 翁志兵,王鵬紅,趙力,等.層析填料中頑固色素去除的新方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2022,41(02):106-111.