免疫組織化學(xué)(IHC)是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測(cè)和定位組織樣本中特定抗原或分子的技術(shù)。由于抗原的位置可提供關(guān)于其生物作用及組織完整性、發(fā)育階段等信息，因此，IHC具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，是疾病診斷和腫瘤分期的重要工具。

傳統(tǒng)的IHC實(shí)驗(yàn)使用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行顯色檢測(cè)，一次只能在載玻片上檢測(cè)到一種抗原。而多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)（如Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)）的應(yīng)用，大大增強(qiáng)了載玻片上的信息獲取，有效提高了診斷的準(zhǔn)確性。

同時(shí)，Sapphire FL具有5-1000μm可調(diào)節(jié)的高分辨率，可快速篩選分類，挑選最好的切片進(jìn)行顯微分析，免于對(duì)所有切片進(jìn)行顯微鏡成像觀測(cè)的耗時(shí)繁瑣。此外，Sapphire FL獲取的完整載玻片圖像，可對(duì)顯微鏡捕獲的小切片圖像進(jìn)行補(bǔ)充。

— 實(shí)驗(yàn)案例：小鼠肺組織切片的IHC成像 —
使用Sapphire FL，對(duì)小鼠肺組織切片進(jìn)行多重?zé)晒釯HC成像，對(duì)切片中的兩種抗原進(jìn)行檢測(cè)。

材料與方法
1. 小鼠肺組織的制備
將小鼠肺組織的石蠟塊切片置于載玻片上，60度烘烤45分鐘。組織切片使用二甲苯和乙醇洗滌，進(jìn)行脫臘、水化。分別使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和PBS洗滌2次，每次5分鐘。

2. 抗原修復(fù)
脫臘及水化完成后，載玻片在Tris-EDTA Tween®緩沖液(pH 9)中，使用電飯鍋孵育22分鐘。隨后等待20分鐘，使載玻片回至室溫后，在PBS中洗滌兩次，每次10分鐘。

3.免疫檢測(cè)
為檢測(cè)切片中的血管內(nèi)皮(VE)鈣粘蛋白和平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)，采用兔抗VE鈣粘蛋白和小鼠抗SMA 為一抗。將組織切片在Power BlockTM 中封閉12分鐘。使用含0.5% Triton的PBS緩沖液稀釋一抗：兔抗VE鈣粘蛋白抗體及小鼠抗SMA抗體的稀釋比例分別為1:100和1:200。將載玻片與一抗冷藏孵育過(guò)夜。隨后使用TBS洗滌兩次，每次5分鐘，再用TBS- tween®洗滌一次，除去未結(jié)合的一抗。

使用熒光標(biāo)記的二抗，AzureSpectra山羊抗兔550 (Azure Biosystems產(chǎn)品#AC2158) 和AzureSpectra山羊抗鼠650 (Azure Biosystems產(chǎn)品#AC2166)對(duì)一抗進(jìn)行檢測(cè)。使用含0.5% TritonTM的PBS緩沖液對(duì)二抗進(jìn)行1:500稀釋。將載玻片置于二抗溶液中室溫孵育1小時(shí)。

隨后使用TBS洗滌兩次，每次5分鐘，再用TBS- tween®洗滌一次，洗去未結(jié)合的二抗，并蓋上蓋玻片進(jìn)行成像。

4. 成像
使用532nm和638nm標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)模塊和擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍(EDR)功能，在Sapphire FL上對(duì)切片進(jìn)行成像。聚焦類型選擇Slide，將焦距設(shè)置在玻璃成像表面上方+1.00 mm。圖像以5μm分辨率拍攝，質(zhì)量設(shè)置為High（高）。

結(jié)果

圖1. 小鼠肺組織切片探測(cè)血管內(nèi)皮（VE）-鈣粘蛋白（紅色，AzureSpectra 550nm二抗）和光滑肌肉肌動(dòng)蛋白（SMA）（綠色，AzureSpectra 650nm二抗）。使用Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)在532nm和638nm通道下成像，分辨率5μm。

圖1顯示了Sapphire FL拍攝的多重?zé)晒釯HC實(shí)驗(yàn)圖像。載玻片中的小鼠肺組織切片，使用VE-cadherin和SMA進(jìn)行探針檢測(cè)，并使用兩種熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。VE-cadherin使用Sapphire FL 532nm標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)模塊檢測(cè)，在圖像中顯示為紅色。SMA使用Sapphire FL 638nm標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)模塊檢測(cè)，在圖像中顯示為綠色。在5μm分辨率圖像中可很容易地觀察到組織形態(tài)。在圖1中，肺組織區(qū)域被放大，局部SMA染色可更詳細(xì)地可視化。

結(jié)論
使用Sapphire FL可對(duì)熒光標(biāo)記的腫瘤，輕松實(shí)現(xiàn)可視化。同時(shí)對(duì)于未被標(biāo)記的腫瘤，也可實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的成像檢測(cè)。

Sapphire FL具有集成的麻醉端口，搭配合適的導(dǎo)管和鼻錐，即可實(shí)現(xiàn)活體小鼠的麻醉成像；高達(dá)4cm的樣品倉(cāng)，支持小鼠、植物、培養(yǎng)皿及其它大型生物樣品成像。除熒光成像外，Sapphire FL還可靈活實(shí)現(xiàn)近紅外熒光、磷屏、化學(xué)發(fā)光及可見(jiàn)光的多功能成像應(yīng)用，賦能實(shí)驗(yàn)室多樣化、更深入的科研需求！