導(dǎo)讀

毒性霍亂弧菌血清群O1和O139是導(dǎo)致全球霍亂流行的病原體。霍亂弧菌可在水中存活，并通過糞-口途徑傳播。提升快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)環(huán)境水體中霍亂弧菌的能力是預(yù)防和控制霍亂傳播的重要戰(zhàn)略。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法被廣泛用于霍亂弧菌的檢測(cè)，是檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但需要較長的時(shí)間和精力。因此，快速準(zhǔn)確新檢測(cè)方法的開發(fā)是必要的。

文獻(xiàn)解讀：

福建省疾病預(yù)防控制中心于Frontiers in Microbiology（影響因子IF：5.2）發(fā)表了名為《Absolute quantification of viable Vibrio cholerae in seawater samples using multiplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide》的研究論文，開發(fā)了一種新的檢測(cè)方法，將三重?cái)?shù)字PCR（dPCR）與單氮化丙啶（PMA）處理相結(jié)合，定量檢測(cè)活霍亂弧菌O1/O139和霍亂腸毒素（ctxA）。在模擬海水樣品中評(píng)價(jià)了PMA-dPCR檢測(cè)活菌源DNA的特異性和敏感性。

應(yīng)用亮點(diǎn)

▶ 與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，數(shù)字PCR技術(shù)更省時(shí)省力、靈敏度和特異性高、抗干擾能力強(qiáng)。

▶ 使用PMA結(jié)合qPCR計(jì)數(shù)VBNC狀態(tài)下的霍亂弧菌O1，在同時(shí)檢測(cè)或區(qū)分活霍亂弧菌O1和O139以及了解ctxA基因的攜帶狀態(tài)方面仍存在局限性，與之相比，使用PMA結(jié)合dPCR技術(shù)的靈敏度和特異性都更好。

 文章相關(guān)結(jié)果：

dPCR檢測(cè)中，rfb O1、rfb O139和ctxA的最佳引物濃度分別為1μM，而三種探針的濃度分別為0.25、0.25和0.4μM。最佳退火溫度為58°C，以獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果。從PMA處理中區(qū)分活死細(xì)菌的最佳策略是在20 μM濃度下孵育15min，然后暴露于650w鹵素?zé)?0 min。

圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時(shí)間后死菌的(C) qPCR結(jié)果。ΔCt=對(duì)照組PMA-Ct值-處理實(shí)驗(yàn)組的Ct值。NT：未經(jīng)PMA處理的對(duì)照組

在純培養(yǎng)溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測(cè)限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應(yīng)，而海水樣品中三個(gè)靶標(biāo)的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應(yīng)。

圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時(shí)間后死菌的(C) qPCR結(jié)果。ΔCt=對(duì)照組PMA-Ct值-處理實(shí)驗(yàn)組的Ct值。NT：未經(jīng)PMA處理的對(duì)照組

在純培養(yǎng)溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測(cè)限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應(yīng)，而海水樣品中三個(gè)靶標(biāo)的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應(yīng)。

圖例說明：使用三重dPCR同時(shí)檢測(cè)霍亂弧菌的兩個(gè)或三個(gè)靶點(diǎn)

圖例說明：采用平板計(jì)數(shù)、qPCR、PMA-qPCR和PMA-triplex dPCR定量不同比例活菌下的霍亂弧菌O1和O139

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