spheroONE球狀組織分選在自動(dòng)化和高度可重復(fù)的3D細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
CELLENION* UPM
將GrowDex®和spheroONE結(jié)合以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高度可重復(fù)的3D細(xì)胞培養(yǎng)工作流程
摘要
本應(yīng)用說明展示了spheroONE和GrowDex®的兼容性,用于自動(dòng)化3D細(xì)胞培養(yǎng)工作流程。
spheroONE是一款納升級(jí)細(xì)胞分選儀,可以分選和分離球形細(xì)胞和器官組織。GrowDex® 是一種植物提取的納米纖維素 (NFC) 水凝膠,為培養(yǎng)各種類型的細(xì)胞提供有效的3D基質(zhì)。在這項(xiàng)工作中,研究人員證明,在這種納米纖維素基質(zhì)中播種的單個(gè) HepG2 細(xì)胞可以無縫地培育出大量 HepG2 球形樣本。隨后,spheroONE可用于自動(dòng)分配GrowDex®到微孔板中,以便對(duì)單個(gè)HepG2球體進(jìn)行分選、分離和嵌入,為后續(xù)的篩選應(yīng)用準(zhǔn)備高度可重復(fù)的檢測(cè)就緒微孔板。
介紹
近年來，人們對(duì)3D模型的興趣激增，這是因?yàn)樗鼈兣c傳統(tǒng)的2D模型相比更具有生理學(xué)的相關(guān)性。這些3D模型表現(xiàn)出獨(dú)特的特征，如空間結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散阻隔、獨(dú)特的基因表達(dá)模式和耐藥性。它們已成為再生醫(yī)學(xué)研究和抗腫瘤藥物篩選的首選。我們的研究提供了一個(gè)專門針對(duì)HepG2球體的解決方案。該模型應(yīng)用廣泛，包括肝病建模（非酒精性脂肪肝、肝癌、病毒性肝炎）、肝毒性評(píng)估以及了解藥物在生理環(huán)境下對(duì)肝細(xì)胞的影響。HepG2 球形細(xì)胞還有助于肝臟代謝、酶活性和基因表達(dá)分析，揭示各種肝臟相關(guān)疾病的復(fù)雜分子機(jī)制。確保使用3D模型進(jìn)行可重復(fù)的高通量篩選取決于基于大小和形態(tài)選擇高度均勻的球體群體。這種均勻性是可靠和可重復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，需要適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基質(zhì)來保證球形體的持續(xù)生長(zhǎng)和活力，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期篩選。為此，我們推出了一種將先進(jìn)的spheroONE技術(shù)與GrowDex®的優(yōu)質(zhì)特性相結(jié)合的解決方案。
SpheroONE是一種創(chuàng)新型儀器，專為分離和分選球形體、腫瘤細(xì)胞和器官組織等大顆粒而設(shè)計(jì)。它的自動(dòng)化功能簡(jiǎn)化了工作流程并提高了效率。此外，它還能精確分配緩沖液和培養(yǎng)基，是一種適用于多種應(yīng)用的多功能工具。
另一方面，GrowDex® 水凝膠是不含動(dòng)物成分的植物提取納米纖維素 (NFC) 水凝膠，可為培養(yǎng)各種類型的細(xì)胞提供有效的3D基質(zhì)。GrowDex 類似于人體的細(xì)胞外基質(zhì)，支持細(xì)胞生長(zhǎng)，并使分子易于擴(kuò)散。GrowDex® 與自動(dòng)化兼容，不需要特殊的處理和儲(chǔ)存條件，易于操作，因此非常適合各種基于3D細(xì)胞的篩選應(yīng)用。先進(jìn)的SpheroONE技術(shù)與成熟的GrowDex®之間的共生協(xié)同效應(yīng)在3D細(xì)胞培養(yǎng)和篩選領(lǐng)域樹立了新的標(biāo)準(zhǔn)，為研究人員提供了一個(gè)強(qiáng)大而多功能工具，以促進(jìn)他們的研究并加速科學(xué)發(fā)現(xiàn)。
方法與結(jié)果
A. 在GrowDex® 中形成HepG2球形細(xì)胞：
HepG2細(xì)胞在完整培養(yǎng)基中傳統(tǒng)單層培養(yǎng)4天。通過將GrowDex®原液（1.5% w/v）與完整培養(yǎng)基稀釋，制備GrowDex® 工作溶液（0.5% w/v）。收獲 HepG2 細(xì)胞,并以 10^5 cells/mL 的濃度將其重新懸浮在GrowDex® 工作溶液
（0.5%w/v）中。將懸浮在GrowDex®中的細(xì)胞移液至96孔底平底ULA板的每個(gè)孔中（100 µL/孔）,結(jié)果每孔約有 10,000 個(gè)細(xì)胞。隨后，用移液管將完全培養(yǎng)基移入每個(gè)孔（100 µL/孔）,置于細(xì)胞負(fù)載的 GrowDex® 層之上（圖 1）。最后,將微孔板置于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下（37°C,5%CO2）培養(yǎng) 5 天，得到 HepG2 球形細(xì)胞。
圖1. 在GrowDex®中高通量形成HepG2球體的過程。
a. HepG2 細(xì)胞的2D培養(yǎng)。 b. 收獲細(xì)胞并將其重新懸浮在用培養(yǎng)基稀釋的 GrowDex® 中。c. 將 100µL HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)在 GrowDex® 中的每個(gè)孔中并加入100µL細(xì)胞培養(yǎng)基。d. 培養(yǎng) 5 天后在 GrowDex® 中形成 HepG2 球形細(xì)胞。
培養(yǎng)5天后,每孔產(chǎn)生約1400個(gè)HepG2 小球。顯微鏡成像顯示了直徑約為50至130微米的異質(zhì)球體群。
B.使用spheroONE進(jìn)行GrowDex®配液：spheroONE能夠自動(dòng)分配各種溶液和試劑（粘度高達(dá)22.5 mPa*s，如70%甘油溶液）。spheroONE 由一個(gè)加壓儲(chǔ)液器、一個(gè)電磁閥和一個(gè)小孔徑噴嘴組成,可實(shí)現(xiàn)高精度的納升級(jí)按需滴加。通過控制滴液體積和點(diǎn)滴次數(shù),它為微孔板的每個(gè)孔提供了一種通用解決方案,可重復(fù)地填充納升至微升級(jí)別的溶液體積。
在這項(xiàng)研究中,SpheroONE 成功地將 GrowDex® 0.5% w/v 自動(dòng)分配到 384 ULA 板（15 µL/孔）中。使用 600 µm納米噴點(diǎn)毛細(xì)管（NDC 600）噴點(diǎn)水凝膠,閥門參數(shù)如下:壓力為 mBar，啟動(dòng)時(shí)間為 1500 ms。使用SpheroONE進(jìn)行自動(dòng)孔預(yù)填充大大方便了微孔板制備，并顯著減少了氣泡的形成，而氣泡的形成通常會(huì)阻礙手動(dòng)移液的微孔板制備。
C.使用spheroONE分離HepG2球形顆粒：
借助spheroONE的光學(xué)系統(tǒng)（包括高分辨率攝像頭、暗場(chǎng)照明模塊）和玻璃 NDC，它能夠檢測(cè)、分析、排序和分離直徑在50至600范圍內(nèi)的顆粒。當(dāng)顆粒沉降減少時(shí)，使用spheroONE進(jìn)行顆粒的分離和回收效果大大提高。在這項(xiàng)研究中，將球狀體在GrowDex®中重新懸浮，顯著減輕了顆粒的沉降，從而大大提高了回收和分離效率。
在球形體分離當(dāng)天,將GrowDex® 中的100µL 球形體培養(yǎng)物（在 A 部分中制備）重懸于2mLPBS 中,以獲得GrowDex® 0.025%w/v中約700個(gè)球狀體/mL的最終濃度。隨后將該樣品放入spheroONE的儲(chǔ)液器中,并與預(yù)填充的384 ULA 板（在 B 部分中制備）一起安裝在spheroONE內(nèi)。
spheroONE安裝了NDC 300（直徑 300 μm），并設(shè)置了以下閥門參數(shù):壓力為200mBar,啟動(dòng)時(shí)間為 10 ms。檢測(cè)和分離參數(shù)設(shè)置如下表1所示。
圖2. 使用spheroONE 對(duì)HepG2 球體進(jìn)行排序和隔離。
a. 暗視野圖像展示一個(gè)球體（直徑99 微米,長(zhǎng)徑比：1.68）。b. 顯微鏡圖像展示在384 ULA 板孔內(nèi)分離的一個(gè)球體。c. 散點(diǎn)圖表示實(shí)驗(yàn)期間檢測(cè)到的球體,綠色表示分離的球體,黃色表示由于NDC 中存在多個(gè)顆粒而未分離的球體，粉色表示不符合分離標(biāo)準(zhǔn)的球體。
在 384 ULA 板的每個(gè)孔中,單個(gè) HepG2 球形體被成功分離到預(yù)填充的 GrowDex® 層上（圖 2）。然后使用spheroONE進(jìn)行另外兩個(gè)試劑分配步驟：每個(gè)孔中再加入 15 µl 0.5% w/v 的 GrowDex® 以完全包埋球形體；最后，在包埋的 HepG2 球形體上分配 25µl 完全培養(yǎng)基,以獲得可用于進(jìn)一步培養(yǎng)和/或篩選的平板。
研究結(jié)論
這項(xiàng)研究成功證明了 GrowDex® 和 spheroONE 在3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)微孔板制備自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化方面的協(xié)同作用。第一步展示了使用 GrowDex® 在單個(gè) 96 孔 ULA 板中高通量形成 10 萬(wàn)多個(gè) HepG2 球形細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。在第二步中，SpheroONE 被用作試劑分配器，在 384 孔 ULA 板的每個(gè)孔中預(yù)先填充一層 GrowDex®。隨后，用SpheroONE裝入HepG2球形體, 然后在384孔ULA板內(nèi)對(duì)單個(gè)球體進(jìn)行排序和分離。最后,用 spheroONE 再分裝一層 GrowDex®，將每個(gè)小球完全包埋，并在頂部加入培養(yǎng)基（圖3）,以獲得可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或篩選應(yīng)用的微孔板。
這一工作流程的主要優(yōu)勢(shì)在于其簡(jiǎn)化的自動(dòng)化操作，通過使用spheroONE既能將規(guī)定體積的 GrowDex®（和試劑）精確分配到預(yù)定義的目標(biāo)平板中，又能高精度地排序和分離單個(gè)球體。
這種創(chuàng)新方法展示了在 GrowDex® 中高效率和高通量準(zhǔn)備球體的成本效益，然后在準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)板中自動(dòng)準(zhǔn)備具有單個(gè)球體的統(tǒng)一孔位，這將對(duì)高度可重復(fù)的3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生重要影響。
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