Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)在HeLa細(xì)胞的STAT3/pSTAT3測(cè)定中的應(yīng)用
隨著生命科學(xué)研究的深入發(fā)展，精準(zhǔn)、高通量且通用的技術(shù)方法在細(xì)胞反應(yīng)及生物過(guò)程研究中的需求愈加強(qiáng)烈。傳統(tǒng)的Western blot需要細(xì)胞裂解和破壞細(xì)胞環(huán)境，而活細(xì)胞成像通常缺乏免疫檢測(cè)的分子特異性。In-Cell Western（ICW）結(jié)合免疫熒光染色和Western blot技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可直接定量評(píng)估細(xì)胞內(nèi)和周?chē)?xì)胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)表達(dá)和修飾，保留關(guān)鍵的生理背景。
為確保ICW實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，全細(xì)胞染色和高級(jí)成像至關(guān)重要。全細(xì)胞染色為數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和歸一化奠定了基礎(chǔ)，確保反映單個(gè)細(xì)胞的真實(shí)變化，而非細(xì)胞密度的差異。
為捕捉微妙、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞反應(yīng)及細(xì)微差別，高性能、高分辨的激光掃描成像系統(tǒng)不可或缺。Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)專為卓越生物成像而生。多重?zé)晒鈾z測(cè)顯著提高實(shí)驗(yàn)效率，成像通道間無(wú)信號(hào)串?dāng)_，保障數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)合高質(zhì)量、經(jīng)驗(yàn)證的試劑，能有效區(qū)分特定信號(hào)，甚至可捕獲蛋白質(zhì)表達(dá)中最細(xì)微的變化。
材料與方法
· 細(xì)胞培養(yǎng)
將HeLa細(xì)胞連續(xù)稀釋后，以115μL /孔的體積接種于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)皿孵育過(guò)夜，隨后用IFN-α處理4-12列的細(xì)胞15分鐘。PBS清洗后，方可進(jìn)行ICW實(shí)驗(yàn)。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定細(xì)胞20分鐘后，使用AzureCyto™滲透液孵育5分鐘。隨后用AzureCyto封閉液室溫振蕩封閉1小時(shí)。根據(jù)表1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行STAT3和/或pSTAT3檢測(cè)。將一抗與AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C過(guò)夜，進(jìn)行全細(xì)胞染色。PBS洗滌后，將AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室溫孵育30分鐘。PBS沖洗后可進(jìn)行成像。
表1.孔板列的處理及檢測(cè)參照表
· 多通道熒光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)模塊進(jìn)行成像，分辨率為10µm，焦距設(shè)置為+3.00mm。
· 蛋白歸一化
為解釋孔間的細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量差異，將每孔的目的蛋白信號(hào)歸一化為該孔的全細(xì)胞染色信號(hào)值。找出稀釋系列中強(qiáng)度最高的全細(xì)胞信號(hào)值，將其他每孔的信號(hào)值除以該最大值，得出每孔的歸一化因子。再將每孔的目的蛋白信號(hào)除以相應(yīng)的歸一化因子，得到歸一化信號(hào)值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
pSTAT3在IFN-α作用下表達(dá)量增加，有力地證明了結(jié)合全細(xì)胞染色歸一化，ICW可有效捕獲強(qiáng)劑量和治療反應(yīng)。考慮到孔間的細(xì)胞體積差異，全細(xì)胞歸一化有助于確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。值得注意的是，在此ICW實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)掃描通道間信號(hào)無(wú)串?dāng)_，增強(qiáng)了數(shù)據(jù)的可靠性和完整性。
結(jié)果與討論
ICW是深入了解細(xì)胞信號(hào)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的有力工具，在高通量藥物和治療篩選方面具有廣泛而重要的應(yīng)用。結(jié)合Sapphire FL此類(lèi)高靈敏、高性能的先進(jìn)成像系統(tǒng)，ICW成為一種強(qiáng)大的通用型工具，可捕捉蛋白表達(dá)及細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)態(tài)、微妙變化。
Sapphire FL具有5-1000μm可調(diào)節(jié)分辨率，飛克級(jí)檢測(cè)靈敏度，呈獻(xiàn)高質(zhì)量數(shù)據(jù)。其兼容多種樣本，除了凝膠、印跡或載玻片等平面樣本，還支持孔板、培養(yǎng)皿和小型模式生物等厚樣本類(lèi)型。
除多重?zé)晒獬上裢猓?a href="#wechat_redirect">Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)還可靈活實(shí)現(xiàn)近紅外熒光、磷屏、化學(xué)發(fā)光及可見(jiàn)光等多功能成像應(yīng)用，賦能實(shí)驗(yàn)室多樣化、更深入的科研需求！
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Azure Biosystems關(guān)于我們
Azure Biosystems成立于2013年，總部位于美國(guó)加州灣區(qū)，是一家致力于生命科學(xué)領(lǐng)域先進(jìn)生物成像系統(tǒng)研發(fā)、制造、推廣及服務(wù)一體的創(chuàng)新型公司。擁有分子成像領(lǐng)域30余年經(jīng)驗(yàn)的卓越團(tuán)隊(duì)，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系統(tǒng)和Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)已成為技術(shù)領(lǐng)先的特色產(chǎn)品。目前，公司已形成分子凝膠成像、Western Blot、RT-PCR及配套試劑耗材等產(chǎn)品線。
公司成像設(shè)備全球裝機(jī)＞5000臺(tái)，用戶數(shù)量＞30000，包括美國(guó)最高科研機(jī)構(gòu)NIH、梅約診所、哈佛大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、清華大學(xué)、諾華制藥等知名科研院所、醫(yī)院及生物醫(yī)藥企業(yè)等。截至目前，已發(fā)表大量文章，發(fā)表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國(guó)際著名期刊雜志。
為確保ICW實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，全細(xì)胞染色和高級(jí)成像至關(guān)重要。全細(xì)胞染色為數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和歸一化奠定了基礎(chǔ)，確保反映單個(gè)細(xì)胞的真實(shí)變化，而非細(xì)胞密度的差異。
為捕捉微妙、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞反應(yīng)及細(xì)微差別，高性能、高分辨的激光掃描成像系統(tǒng)不可或缺。Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)專為卓越生物成像而生。多重?zé)晒鈾z測(cè)顯著提高實(shí)驗(yàn)效率，成像通道間無(wú)信號(hào)串?dāng)_，保障數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)合高質(zhì)量、經(jīng)驗(yàn)證的試劑，能有效區(qū)分特定信號(hào)，甚至可捕獲蛋白質(zhì)表達(dá)中最細(xì)微的變化。
— 案例：HeLa細(xì)胞的STAT3/pSTAT3測(cè)定 —
材料與方法
· 細(xì)胞培養(yǎng)
將HeLa細(xì)胞連續(xù)稀釋后，以115μL /孔的體積接種于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)皿孵育過(guò)夜，隨后用IFN-α處理4-12列的細(xì)胞15分鐘。PBS清洗后，方可進(jìn)行ICW實(shí)驗(yàn)。
· In-Cell Western
100%甲醇-20°C固定細(xì)胞20分鐘后，使用AzureCyto™滲透液孵育5分鐘。隨后用AzureCyto封閉液室溫振蕩封閉1小時(shí)。根據(jù)表1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行STAT3和/或pSTAT3檢測(cè)。將一抗與AzureCyto total Cell Stain共孵育，4°C過(guò)夜，進(jìn)行全細(xì)胞染色。PBS洗滌后，將AzureSpectra 700和AzureSpectra 800二抗室溫孵育30分鐘。PBS沖洗后可進(jìn)行成像。
表1.孔板列的處理及檢測(cè)參照表
· 多通道熒光成像
使用Sapphire FL 532nm、685nm和784nm標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)模塊進(jìn)行成像，分辨率為10µm，焦距設(shè)置為+3.00mm。
· 蛋白歸一化
為解釋孔間的細(xì)胞數(shù)量及蛋白含量差異，將每孔的目的蛋白信號(hào)歸一化為該孔的全細(xì)胞染色信號(hào)值。找出稀釋系列中強(qiáng)度最高的全細(xì)胞信號(hào)值，將其他每孔的信號(hào)值除以該最大值，得出每孔的歸一化因子。再將每孔的目的蛋白信號(hào)除以相應(yīng)的歸一化因子，得到歸一化信號(hào)值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
pSTAT3在IFN-α作用下表達(dá)量增加，有力地證明了結(jié)合全細(xì)胞染色歸一化，ICW可有效捕獲強(qiáng)劑量和治療反應(yīng)。考慮到孔間的細(xì)胞體積差異，全細(xì)胞歸一化有助于確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。值得注意的是，在此ICW實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)掃描通道間信號(hào)無(wú)串?dāng)_，增強(qiáng)了數(shù)據(jù)的可靠性和完整性。
結(jié)果與討論
ICW是深入了解細(xì)胞信號(hào)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的有力工具，在高通量藥物和治療篩選方面具有廣泛而重要的應(yīng)用。結(jié)合Sapphire FL此類(lèi)高靈敏、高性能的先進(jìn)成像系統(tǒng)，ICW成為一種強(qiáng)大的通用型工具，可捕捉蛋白表達(dá)及細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)態(tài)、微妙變化。
Sapphire FL具有5-1000μm可調(diào)節(jié)分辨率，飛克級(jí)檢測(cè)靈敏度，呈獻(xiàn)高質(zhì)量數(shù)據(jù)。其兼容多種樣本，除了凝膠、印跡或載玻片等平面樣本，還支持孔板、培養(yǎng)皿和小型模式生物等厚樣本類(lèi)型。
除多重?zé)晒獬上裢猓?a href="#wechat_redirect">Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)還可靈活實(shí)現(xiàn)近紅外熒光、磷屏、化學(xué)發(fā)光及可見(jiàn)光等多功能成像應(yīng)用，賦能實(shí)驗(yàn)室多樣化、更深入的科研需求！
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公司成像設(shè)備全球裝機(jī)＞5000臺(tái)，用戶數(shù)量＞30000，包括美國(guó)最高科研機(jī)構(gòu)NIH、梅約診所、哈佛大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、清華大學(xué)、諾華制藥等知名科研院所、醫(yī)院及生物醫(yī)藥企業(yè)等。截至目前，已發(fā)表大量文章，發(fā)表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國(guó)際著名期刊雜志。
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