內(nèi)皮祖細胞（EPCs）是干細胞的一個亞群，可以響應(yīng)組織或血管損傷而被激活和動員。研究表明，血流動力學(xué)力在 EPC 動員和分化中起著至關(guān)重要的作用，例如，層流已被證明可以刺激 EPC 分化為 ECs。然而，當(dāng)血管受損時，隨之而來的血流紊亂會促進 EPC 向平滑肌細胞的分化。一旦 EPCs 粘附在損傷部位，它們也會暴露于心臟搏動產(chǎn)生的周期性拉伸（CS）中。然而，CS 調(diào)節(jié) EPC 功能的分子機制及其與血管修復(fù)的相關(guān)性在很大程度上仍然未知。

在生理條件下，EPCs s處于靜止?fàn)顟B(tài)，能量需求較低。一旦被內(nèi)皮損傷激活，它們能量需求變高，這需要更多的三磷酸腺苷（ATP）來維持其動員和激活狀態(tài)。線粒體通過氧化磷酸化（OXPHOS）產(chǎn)生 ATP，為細胞提供能量來源。除了通過OXPHOS增加細胞能量的產(chǎn)生外，線粒體還增強了呼吸底物（如脂肪酸）的獲取。脂肪酸通過脂肪酸氧化（FAO）分解代謝，是重要的細胞燃料。線粒體 FAO 通常發(fā)生在需要能量的過程中以產(chǎn)生更多的 ATP。除了作為生物能量和生物合成中心外，線粒體還是機械敏感細胞器，CS 可調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞中 ATP 的產(chǎn)生和線粒體網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。盡管了解線粒體參與調(diào)節(jié)干細胞的命運和功能，但線粒體代謝影響干細胞命運的機制仍然未知，而且機械力如何影響線粒體FAO也知之甚少。

基于此，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)工程研究所的聯(lián)合課題組開展的這項研究是為了探索在血管損傷后再內(nèi)皮化背景下線粒體能量代謝在 EPC 粘附中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS 增強了長鏈脂肪酸（LCFAs）作為線粒體 FAO 底物的使用，從而導(dǎo)致 OXPHOS-依賴性 ATP 合成。這種機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制增加了血管損傷嚙齒動物模型中再內(nèi)皮化所需的 EPCs 中的能量產(chǎn)生。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 The Proceedings of the National Academy of Sciences 期刊題為“Cyclic stretch promotes vascular homing of endothelial progenitor cells via Acsl1 regulation of mitochondrial fatty acid oxidation”。
 

首先，為了研究機械拉伸在 EPC 功能中的作用，在模擬血管壁生理拉伸的情況下，以10% 的強度和1hz的頻率對內(nèi)皮祖細胞進行24 h的機械拉伸。結(jié)果表明，CS增加了EPCs的粘附（圖1 A），并促進EPC分化為EC譜系，如EC標(biāo)志物PECAM-1或CD31和KDR的表達升高以及祖細胞標(biāo)志物CD34的表達降低（圖1 B）。損傷后，血管內(nèi)膜容易發(fā)生血栓和炎癥，部分原因是內(nèi)皮來源的一氧化氮（NO）水平降低。實驗發(fā)現(xiàn) NO 水平確實被 CS 上調(diào)（圖1 C），然而，CS對EPCs的遷移和增殖沒有太大影響。

然后檢測了EPCs的線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)CS降低了點狀區(qū)域的百分比，增加了桿狀和絲狀區(qū)域的百分比（圖1 D）。通過TEM進一步探索EPCs響應(yīng)CS刺激的線粒體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)24 h CS后線粒體形態(tài)由短環(huán)狀變?yōu)殚L桿狀（圖1 E）。同時，CS增加了嵴數(shù)目，減小了嵴寬度，表明OXPHOS活性升高。此外，CS 顯著提高了 EPC 耗氧率（OCR）（圖1 F），CS下的EPCs也產(chǎn)生更多的ATP（圖1 G）。這些發(fā)現(xiàn)強化了線粒體-依賴性O(shè)XPHOS被CS上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，機械拉伸促進了 EPC 粘附和內(nèi)皮分化，同時激活了線粒體的呼吸。

圖1 CS 促進 EPC 功能和線粒體能量代謝。

接下來，實驗進一步研究了 CS 和 ST 條件下 EPCs 代謝物中的線粒體相關(guān)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS下與ST 下EPCs產(chǎn)生的代謝物存在顯著差異。在變化顯著的前6種代謝物中，CS顯著降低了棕櫚酸（PA）、亞油酸（LA）、硬脂酸（SA）和乙酰膽堿水平，顯著提高了異丁酸和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）水平。所有這些代謝物都與脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)。這些代謝分析得出的結(jié)論是，F(xiàn)AO通路的變化與CS處理的EPCs中增強的線粒體呼吸和ATP的產(chǎn)生有關(guān)。

然后通過使用Seahorse Mito 壓力測試系統(tǒng)研究了增加CS后FAO的功能后果。在暴露于CS的EPCs 中，用 FAO 抑制劑ETO預(yù)處理可消除CS誘導(dǎo)的最大呼吸和備用呼吸量。同時，基礎(chǔ)呼吸水平和急性反應(yīng)也較低。這些結(jié)果表明，CS對EPCs線粒體呼吸的增強是通過FAO介導(dǎo)的。MitoTracker Red 染色顯示，CS 增加了桿狀和絲狀線粒體的百分比。此外，與在CS下未接受ETO處理的EPCs相比，ETO處理的EPCs顯示出桿狀和絲狀線粒體的數(shù)量減少（圖2 B）。而且ETO減弱了CS誘導(dǎo)的EPC粘附和ATP產(chǎn)生（圖2 C、D）。因此，EPCs中CS增強的線粒體呼吸和ATP產(chǎn)生是通過FAO途徑催化的LCFAs介導(dǎo)的。

圖2 ETO抑制FAO可消除CS誘導(dǎo)的線粒體呼吸作用。

由于FAO途徑催化的LCFAs是受CS影響最顯著的EPCs代謝產(chǎn)物，因此實驗通過檢測EPCs中響應(yīng)CS的FAO和脂肪酸生物合成相關(guān)酶的水平，探索了參與LCFAs機械調(diào)控的關(guān)鍵酶（圖3 A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS在蛋白質(zhì)水平上上調(diào)了Acsl1 水平（圖3 C）。進一步分析證實，CS上調(diào)了位于線粒體的Acsl1（圖3 D、E）。在功能獲得方法中，用過表達 Acsl1 的慢病毒（LV-Acsl1）感染 EPCs 增加了 ST 條件下 EPC 的粘附（圖3 F），而在功能喪失實驗中，轉(zhuǎn)染 Acsl1 siRNA 的 EPCs 在 CS 下的粘附性降低（圖3 F）。線粒體呼吸因 Acsl1 過表達而顯著上調(diào)，因 Acsl1 敲低則顯著下調(diào)（圖3 G、H）。此外，ETO 和 Acsl1 敲低對 FAO 的抑制顯著抑制了 EPC 分化。這些數(shù)據(jù)表明，CS 顯著誘導(dǎo) Acsl1，而 Acsl1 又通過誘導(dǎo) FAO 來增強線粒體呼吸。

圖3 Acsl1是受CS調(diào)控的EPCs中FAO的關(guān)鍵酶。

最后，通過使用大鼠內(nèi)膜損傷模型，實驗驗證了體內(nèi) Acsl1 在 EPC 血管歸巢中的作用（圖4 A）。在左頸動脈損傷手術(shù)后立即將Acsl1獲得或喪失功能的EPCs移植到大鼠內(nèi)膜損傷模型中（圖4 B）。在接受 Acsl1 過表達 EPCs 的大鼠中，頸動脈損傷部位的熒光強度增加，從而表明 EPCs 對損傷血管的粘附性增強（圖4 C）。與未處理的 EPCs的動物相比，接受 Acsl1 siRNA 的 EPCs 的動物粘附的 EPCs更少（圖4 D）。然后檢測內(nèi)膜損傷后的再內(nèi)皮化，無染色區(qū)域提示再內(nèi)皮化，發(fā)現(xiàn)感染LV-Acsl1的EPCs的大鼠在損傷部位出現(xiàn)明顯的血管修復(fù)（圖4 E）。

冠狀 MRI T2 加權(quán)圖像顯示，內(nèi)皮損傷和血管重塑導(dǎo)致部分血流停止。感染 LV-Acsl1 的 EPCs 移植顯著降低了損傷部位的 T2 加權(quán)信號（圖4 F）。此外，生理鹽水組損傷血管內(nèi)的 T2 加權(quán)信號增加，而 EPCs 移植血管的 T2 加權(quán)信號降低，尤其是在感染 LV-Acsl1 的 EPCs 中（圖4 G）。從生理鹽水組獲得的頸動脈血流被阻塞（圖4 H），表明嚴(yán)重的血管再狹窄。在 EPC 移植中，LV-Acsl1 組的血流恢復(fù)最為顯著。MRI后，對這些血管標(biāo)本進行了組織學(xué)檢查，顯示生理鹽水組新內(nèi)膜厚度大于EPC處理組（圖4 I）。重要的是，LV-Acsl1組的動脈新生內(nèi)膜最少，管腔面積保存最多（圖4 I），加強了 Acsl1 調(diào)控的 FAO 對 EPC 血管歸巢和修復(fù)的有益作用。這些數(shù)據(jù)表明，移植的 EPCs 的 Acsl1 過表達促進體內(nèi)內(nèi)膜損傷的修復(fù)。

圖4 Acsl1改善大鼠頸動脈損傷模型中EPC功能。

總之，該研究數(shù)據(jù)表明，CS 上調(diào)的 Acsl1 增強了 EPCs中的線粒體呼吸，將機械轉(zhuǎn)導(dǎo)和 OXPHOS 與 EPC 血管修復(fù)功效聯(lián)系起來。因此，該研究為血管損傷后內(nèi)皮修復(fù)提供了見解。

參考文獻：Han Y, Yan J, Li ZY, Fan YJ, Jiang ZL, Shyy JY, Chien S. Cyclic stretch promotes vascular homing of endothelial progenitor cells via Acsl1 regulation of mitochondrial fatty acid oxidation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 7;120(6):e2219630120. doi: 10.1073/pnas.2219630120. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36716379; PMCID: PMC9963562.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36716379/

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