活細(xì)胞成像儀應(yīng)用于細(xì)胞凋亡研究實(shí)例分享
細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)常用檢測方法包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定、線粒體膜電位檢測、細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（PS）檢測以及凋亡分子標(biāo)記檢測。以上方法步驟繁瑣，只能觀察最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，那么有什么新方法可以彌補(bǔ)這種不足呢？本文將介紹一種新方法——使用活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)時(shí)動態(tài)成像，監(jiān)測細(xì)胞變化情況。我們分析了新方法對比常用方法的優(yōu)勢，同時(shí)列舉了幾篇活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)應(yīng)用在細(xì)胞凋亡方向的高分文章，新方法獲得了科研人員的認(rèn)可，在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用。
細(xì)胞死亡是最重要的生物進(jìn)程之一。當(dāng)機(jī)體存在衰老或損傷細(xì)胞需要清除，細(xì)胞死亡便作為第一步發(fā)揮作用。根據(jù)機(jī)制不同，細(xì)胞死亡可分為細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、自噬、壞死或壞死性凋亡。細(xì)胞凋亡，或者說程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death），刺激因素多源自細(xì)胞內(nèi)部。凋亡過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化（圖1），在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜脫落，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞器解體。在細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)等，形成凋亡小體。
細(xì)胞凋亡可由內(nèi)在途徑或外在途徑誘導(dǎo)（圖2）。內(nèi)在途徑起源于線粒體，線粒體通過釋放細(xì)胞色素C誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)。Caspase能夠降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。外在途徑依賴于胞外信號通路，如TNF、FAS。這些分子與TNF受體家族結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（DISC）。最后內(nèi)在和外在途徑共同引起蛋白水解酶Caspase-3的激活，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。
細(xì)胞凋亡在癌癥和神經(jīng)疾病研究領(lǐng)域尤為重要。在幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，不必要的神經(jīng)細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致生命危險(xiǎn)；另一方面，選擇性地誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡也是一種有效的疾病治療方法。了解細(xì)胞凋亡背后的機(jī)制有助于預(yù)防疾病導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，并能找到更好的抗癌策略。
目前檢測細(xì)胞凋亡的方法主要有顯微鏡觀察法、線粒體膜電位檢測、細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（PS）檢測以及凋亡分子標(biāo)記檢測。
1. 顯微鏡觀察法
凋亡過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，可對細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。
2. 線粒體膜電位（Δψm）檢測：
細(xì)胞凋亡過程中涉及線粒體膜電位的變化�？缒る娢幌陆当徽J(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中早發(fā)生的事件，出現(xiàn)在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA 斷裂）之前。使用JC-1或TMRM染料，通過流式細(xì)胞分析或熒光成像檢測線粒體膜電位差。
3. 細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（PS）檢測：
Annexin V是膜聯(lián)蛋白組的一個成員，如果PS翻轉(zhuǎn)到膜的外側(cè)，Annexin V就會與質(zhì)膜中的PS發(fā)生高親和力結(jié)合。將 Annexin V與PI相結(jié)合可以確定細(xì)胞凋亡所處的階段。由于PI只能標(biāo)記染色質(zhì)膜受損的細(xì)胞核，因此只有Annexin V陽性的細(xì)胞代表早期凋亡，只有PI陽性的細(xì)胞代表壞死，而Annexin V-PI雙陽性則是晚期凋亡的標(biāo)志。
4. 凋亡分子標(biāo)記檢測：
Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，上游的凋亡信號通過切割Caspase-3使其具備酶活性，執(zhí)行最后的凋亡程序，在凋亡晚期，Caspase-3酶活性降低。實(shí)驗(yàn)者可以通過Western blot對Caspase-3進(jìn)行定量分析，或者借助檢測試劑盒測定Caspase-3活性。
上述常見的細(xì)胞凋亡檢測方法，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，操作繁瑣，且只能得到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無法查看細(xì)胞凋亡完整過程，且個別試劑會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成影響。耗時(shí)、耗力、實(shí)驗(yàn)成功率不能保證，最終影響實(shí)驗(yàn)效率。
那么，使用什么樣的工具可以改善這些問題呢？
奎克泰生物的JuLI™系列實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像分析儀能夠放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，對細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察、拍攝記錄生長周期的全過程，在保持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定的情況下，同時(shí)對細(xì)胞計(jì)數(shù)、拍照，形成視頻、融合度、生長曲線，提供細(xì)胞凋亡過程視頻和量化結(jié)果。此外，JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)具有全自動X-Y-Z軸、三色熒光、自動/手動對焦、Z-Stack、圖像拼接等功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)測和無損成像，通過明場/熒光細(xì)胞圖像，基于圖像分析軟件，鑒定細(xì)胞形態(tài)特征。
研究者可以預(yù)先設(shè)定好拍攝參數(shù)，通過延時(shí)攝影監(jiān)測并評估細(xì)胞凋亡情況，提供細(xì)胞凋亡量化結(jié)果。
對比常規(guī)細(xì)胞凋亡檢測方法，活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)大大縮減了人工操作的繁瑣性、提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、成功率，省時(shí)省力，為研究人員帶來了便利。
以下來自世界各地知名機(jī)構(gòu)發(fā)布的3篇文章，均為使用JuLI™系列活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)做的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。
1. 來自韓國國立癌癥中心免疫治療科的研究人員在《Nature Communications》發(fā)表題為“Desensitized chimeric antigen receptor T cells selectively recognize target cells with enhanced antigen expression”的文章[2]，研究人員應(yīng)用了細(xì)胞凋亡試劑盒，使用JuLI™ Stage測定EBV LCLs細(xì)胞凋亡動力學(xué)。研究表明CD19 CAR T和MVR CAR T細(xì)胞逐漸增加了EBV LCLs細(xì)胞凋亡比例。每5min拍攝一次DAPI和RFP熒光圖像，持續(xù)記錄90min。
2. 來自墨爾本大學(xué)Bio21分子科學(xué)與生物技術(shù)研究所的研究人員在《Cell Reports》發(fā)表題為“Huntingtin Inclusions Trigger Cellular Quiescence, Deactivate Apoptosis, and Lead to Delayed Necrosis”的文章[3]，研究人員通過GFP-tagged prion domain protein TIA-1和 Httex1(97Q)-Cherry共轉(zhuǎn)染，使用JuLI™ Stage拍攝圖像，共記錄90min。結(jié)果表明在Httex1包涵體形成后，TIA-1進(jìn)入到Httex1包涵體中。
3. 來自匈牙利科學(xué)院自然科學(xué)研究中心酶學(xué)研究所的研究人員在《Molecular Cancer Therapeutics》發(fā)表題為“Identification and Validation of Compounds Selectively Killing Resistant Cancer:Delineating Cell Line-Specific Effects from P-Glycoprotein-Induced Toxicity”的文章[4]，研究者應(yīng)用FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，使用JuLI™ Stage實(shí)時(shí)熒光檢測功能拍攝圖像，根據(jù)圖像熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞凋亡狀態(tài)。
細(xì)胞死亡是最重要的生物進(jìn)程之一。當(dāng)機(jī)體存在衰老或損傷細(xì)胞需要清除，細(xì)胞死亡便作為第一步發(fā)揮作用。根據(jù)機(jī)制不同，細(xì)胞死亡可分為細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、自噬、壞死或壞死性凋亡。細(xì)胞凋亡，或者說程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death），刺激因素多源自細(xì)胞內(nèi)部。凋亡過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化（圖1），在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜脫落，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞器解體。在細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)等，形成凋亡小體。
細(xì)胞凋亡形態(tài)變化圖
細(xì)胞凋亡可由內(nèi)在途徑或外在途徑誘導(dǎo)（圖2）。內(nèi)在途徑起源于線粒體，線粒體通過釋放細(xì)胞色素C誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)。Caspase能夠降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。外在途徑依賴于胞外信號通路，如TNF、FAS。這些分子與TNF受體家族結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（DISC）。最后內(nèi)在和外在途徑共同引起蛋白水解酶Caspase-3的激活，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。
細(xì)胞凋亡的內(nèi)在和外在信號通路
細(xì)胞凋亡在癌癥和神經(jīng)疾病研究領(lǐng)域尤為重要。在幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，不必要的神經(jīng)細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致生命危險(xiǎn)；另一方面，選擇性地誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡也是一種有效的疾病治療方法。了解細(xì)胞凋亡背后的機(jī)制有助于預(yù)防疾病導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，并能找到更好的抗癌策略。
目前檢測細(xì)胞凋亡的方法主要有顯微鏡觀察法、線粒體膜電位檢測、細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（PS）檢測以及凋亡分子標(biāo)記檢測。
1. 顯微鏡觀察法
凋亡過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，可對細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。
2. 線粒體膜電位（Δψm）檢測：
細(xì)胞凋亡過程中涉及線粒體膜電位的變化�？缒る娢幌陆当徽J(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中早發(fā)生的事件，出現(xiàn)在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA 斷裂）之前。使用JC-1或TMRM染料，通過流式細(xì)胞分析或熒光成像檢測線粒體膜電位差。
3. 細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸（PS）檢測：
Annexin V是膜聯(lián)蛋白組的一個成員，如果PS翻轉(zhuǎn)到膜的外側(cè)，Annexin V就會與質(zhì)膜中的PS發(fā)生高親和力結(jié)合。將 Annexin V與PI相結(jié)合可以確定細(xì)胞凋亡所處的階段。由于PI只能標(biāo)記染色質(zhì)膜受損的細(xì)胞核，因此只有Annexin V陽性的細(xì)胞代表早期凋亡，只有PI陽性的細(xì)胞代表壞死，而Annexin V-PI雙陽性則是晚期凋亡的標(biāo)志。
4. 凋亡分子標(biāo)記檢測：
Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，上游的凋亡信號通過切割Caspase-3使其具備酶活性，執(zhí)行最后的凋亡程序，在凋亡晚期，Caspase-3酶活性降低。實(shí)驗(yàn)者可以通過Western blot對Caspase-3進(jìn)行定量分析，或者借助檢測試劑盒測定Caspase-3活性。
上述常見的細(xì)胞凋亡檢測方法，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，操作繁瑣，且只能得到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無法查看細(xì)胞凋亡完整過程，且個別試劑會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成影響。耗時(shí)、耗力、實(shí)驗(yàn)成功率不能保證，最終影響實(shí)驗(yàn)效率。
那么，使用什么樣的工具可以改善這些問題呢？
奎克泰生物的JuLI™系列實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像分析儀能夠放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，對細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察、拍攝記錄生長周期的全過程，在保持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定的情況下，同時(shí)對細(xì)胞計(jì)數(shù)、拍照，形成視頻、融合度、生長曲線，提供細(xì)胞凋亡過程視頻和量化結(jié)果。此外，JuLI™ Stage活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)具有全自動X-Y-Z軸、三色熒光、自動/手動對焦、Z-Stack、圖像拼接等功能，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)測和無損成像，通過明場/熒光細(xì)胞圖像，基于圖像分析軟件，鑒定細(xì)胞形態(tài)特征。
JuLI™系列放置于培養(yǎng)箱中
研究者可以預(yù)先設(shè)定好拍攝參數(shù)，通過延時(shí)攝影監(jiān)測并評估細(xì)胞凋亡情況，提供細(xì)胞凋亡量化結(jié)果。
對比常規(guī)細(xì)胞凋亡檢測方法，活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)大大縮減了人工操作的繁瑣性、提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、成功率，省時(shí)省力，為研究人員帶來了便利。
以下來自世界各地知名機(jī)構(gòu)發(fā)布的3篇文章，均為使用JuLI™系列活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)做的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。
1. 來自韓國國立癌癥中心免疫治療科的研究人員在《Nature Communications》發(fā)表題為“Desensitized chimeric antigen receptor T cells selectively recognize target cells with enhanced antigen expression”的文章[2]，研究人員應(yīng)用了細(xì)胞凋亡試劑盒，使用JuLI™ Stage測定EBV LCLs細(xì)胞凋亡動力學(xué)。研究表明CD19 CAR T和MVR CAR T細(xì)胞逐漸增加了EBV LCLs細(xì)胞凋亡比例。每5min拍攝一次DAPI和RFP熒光圖像，持續(xù)記錄90min。
EBV LCLs細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果圖
2. 來自墨爾本大學(xué)Bio21分子科學(xué)與生物技術(shù)研究所的研究人員在《Cell Reports》發(fā)表題為“Huntingtin Inclusions Trigger Cellular Quiescence, Deactivate Apoptosis, and Lead to Delayed Necrosis”的文章[3]，研究人員通過GFP-tagged prion domain protein TIA-1和 Httex1(97Q)-Cherry共轉(zhuǎn)染，使用JuLI™ Stage拍攝圖像，共記錄90min。結(jié)果表明在Httex1包涵體形成后，TIA-1進(jìn)入到Httex1包涵體中。
GFP標(biāo)記的TIA-1進(jìn)入Httex1包涵體（紅色）結(jié)果圖
3. 來自匈牙利科學(xué)院自然科學(xué)研究中心酶學(xué)研究所的研究人員在《Molecular Cancer Therapeutics》發(fā)表題為“Identification and Validation of Compounds Selectively Killing Resistant Cancer:Delineating Cell Line-Specific Effects from P-Glycoprotein-Induced Toxicity”的文章[4]，研究者應(yīng)用FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，使用JuLI™ Stage實(shí)時(shí)熒光檢測功能拍攝圖像，根據(jù)圖像熒光強(qiáng)度判斷細(xì)胞凋亡狀態(tài)。
NSC57969選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)果圖
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