動脈粥樣硬化主要發(fā)生在血流紊亂（d-flow）的區(qū)域，即流量低、混亂方向的非層流。當(dāng)暴露于 d-flow 時，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生表型變化，導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放和白細(xì)胞募集增加。單核細(xì)胞是白細(xì)胞的主要類型，它們被遷移到發(fā)炎的血管壁中，成為富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞，這是動脈粥樣硬化斑塊的標(biāo)志。

血管損傷后，循環(huán)中的血小板迅速粘附在受傷處內(nèi)膜下組織形成止血栓以填充傷口。血小板還有助于炎癥過程，這在包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的許多病理?xiàng)l件下至關(guān)重要。血小板粘附到血流紊亂區(qū)域被證明通過促進(jìn)單核細(xì)胞粘附來促進(jìn)動脈粥樣硬化形成。研究表明，血小板轉(zhuǎn)錄組特征與動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞有關(guān)。先前的研究揭示了動脈粥樣硬化期間d-flow激活的內(nèi)皮細(xì)胞如何導(dǎo)致白細(xì)胞募集。然而，血小板如何對d-flow產(chǎn)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的機(jī)制仍不清楚。

基于此，蘇州大學(xué)唐仲英醫(yī)學(xué)研究院血液學(xué)研究中心和美國俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究基金會心血管生物學(xué)項(xiàng)目成員在一項(xiàng)研究中，以載脂蛋白E缺陷型（ApoE-/-）和 LDL 受體敲除（LDLr-/-）小鼠為研究對象，建立了小鼠部分頸動脈結(jié)扎術(shù)（PCL）誘導(dǎo)的頸動脈 d-flow 模型，通過免疫染色或透射電子顯微鏡觀察d-flow誘導(dǎo)的血小板在內(nèi)皮下或斑塊中的沉積，通過特異性基因敲除小鼠進(jìn)一步探討了血小板內(nèi)皮下沉積的機(jī)制。研究結(jié)果揭示了血小板在動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域調(diào)節(jié)血管炎癥的新作用。研究成果發(fā)表在 Theranostics 期刊題為“CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice”。

首先，為了研究血小板在d-flow誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化中的作用，實(shí)驗(yàn)使用免疫染色法檢測了喂食高脂飲食（HFD）的LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主動脈弓動脈粥樣硬化斑塊的連續(xù)切片。共聚焦成像分析顯示，4周后LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主動脈弓斑塊中存在血小板。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，LDL-r-/- 小鼠進(jìn)行PCL以產(chǎn)生 d-flow，然后進(jìn)行HFD 喂養(yǎng)以產(chǎn)生頸動脈粥樣硬化。結(jié)果顯示，PCL 1周后的小鼠頸動脈斑塊中CD42d+ 血小板積聚。這些結(jié)果證明，通過單細(xì)胞技術(shù)，血小板與動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)，并暗示血小板可能出現(xiàn)在動脈粥樣硬化的相對早期發(fā)展中。

然后，使用PCL模型繼續(xù)探討了d-flow 是否誘導(dǎo)內(nèi)皮下間隙中的血小板沉積。結(jié)果顯示，d-flow 持續(xù)2天后，除了粘附在LCA的內(nèi)皮上外，還在內(nèi)皮下間隙誘導(dǎo)了大量血小板，相比之下，右頸總動脈（RCA）對照的內(nèi)皮或內(nèi)皮下間隙均未檢測到血小板（圖1 A、B）。使用共聚焦圖像的三維（3D）重建進(jìn)行進(jìn)一步觀察，證實(shí)了豐富的CD42d+ 血小板在內(nèi)皮下間隙的沉積（圖1 C）。為了驗(yàn)證循環(huán)血小板的內(nèi)皮下沉積，將表達(dá)EGFP的血小板注入接受PCL 2天的小鼠中，檢查EGFP標(biāo)記的血小板是否積聚在頸動脈d-flow影響區(qū)域的內(nèi)皮下（圖1 D左）。結(jié)果顯示，PCL后在LCA內(nèi)皮下檢測到表達(dá)EGFP的血小板，但未在RCA檢測到（圖1 D右）。此外，d-flow誘導(dǎo)內(nèi)皮變形以及白細(xì)胞和血小板在擴(kuò)大的內(nèi)皮下間隙中沉積。值得注意的是，血小板可能與單核細(xì)胞接觸（圖1 E）。

圖1 血流紊亂誘導(dǎo)小鼠血小板內(nèi)皮下沉積。

眾所周知，血小板在炎癥期間與白細(xì)胞相互作用并促進(jìn)白細(xì)胞募集。接下來，實(shí)驗(yàn)研究了d-flow下血小板內(nèi)皮下沉積的動態(tài)變化及其與白細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。對PCL后不同時間點(diǎn)頸動脈的定量分析顯示，血小板和F4/80+ 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的內(nèi)膜和內(nèi)皮下沉積在PCL后6 h出現(xiàn)，在2天時達(dá)到峰值，并在7 d后保持一定水平（圖2 A、B、C）。進(jìn)一步檢查顯示，沉積的血小板與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（F4/80+）或中性粒細(xì)胞（Ly6G+）接觸，在PCL后形成單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞-血小板或中性粒細(xì)胞-血小板聚集體（圖2 D），且患區(qū)與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞聚集的血小板占總血小板的百分比顯著高于中性粒細(xì)胞，表明血小板在內(nèi)皮下沉積過程中主要與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相互作用。

此外，還檢查了 d-flow 是否誘導(dǎo)循環(huán)單核細(xì)胞-血小板聚集體（MPA）的增加，因?yàn)檠�環(huán) MPA 是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病機(jī)制的標(biāo)志物。結(jié)果表明，PCL術(shù)后2天循環(huán)血液中MPA與總單核細(xì)胞的比值增加（圖2 E）。這些結(jié)果支持了d-flow下血小板的內(nèi)皮下沉積與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相關(guān)的觀點(diǎn)。

然后，實(shí)驗(yàn)探索了哪種類型的分子介導(dǎo)了 d-flow 誘導(dǎo)的血小板-單核細(xì)胞相互作用和內(nèi)皮下沉積。已發(fā)現(xiàn)血小板 CLEC-2 調(diào)節(jié)血管完整性，然而，CLEC-2 是否有助于 d-flow 誘導(dǎo)的血小板和單核細(xì)胞相互作用及其內(nèi)皮下沉積尚不清楚。為了測試血小板 CLEC-2 是否調(diào)節(jié)體內(nèi) d-flow 誘導(dǎo)的血小板內(nèi)皮下沉積，使用小鼠模型Clec2fl/fl 和 Pf4-Cre。PCL后顯示血小板以MPA形式或單獨(dú)形式沉積在WT小鼠變形內(nèi)皮區(qū)域，而血小板敲除CLEC-2可顯著抑制血小板和單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的沉積。為了研究CLEC-2是否有助于d-flow誘導(dǎo)的血小板和單核細(xì)胞相互作用，使用小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系RAW264.7，發(fā)現(xiàn)血小板孵育促進(jìn)了RAW264.7的遷移，而與CLEC-2敲除血小板一起孵育可減少RAW264.7細(xì)胞遷移。這些結(jié)果表明，CLEC-2 在介導(dǎo)單核細(xì)胞-血小板相互作用及其 d-flow 下內(nèi)皮下沉積中起主要作用。

圖2 d-flow 誘導(dǎo)的血小板內(nèi)皮下沉積與單核/巨噬細(xì)胞有關(guān)。

最后，為了研究血小板 CLEC-2 如何介導(dǎo)單核細(xì)胞-血小板聚集體的形成，研究人員檢測了 d-flow 是否誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)平足蛋白（PDPN），PDPN 是一種I型跨膜糖蛋白和已知的 CLEC-2 內(nèi)源性配體，據(jù)報道在炎癥期間在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上表達(dá)。首先在體外分析了 RAW264.7 細(xì)胞在振蕩流（OS，10 ± 5 dyn/cm²）刺激 12 小時后的 PDPN 表達(dá)，結(jié)果顯示，OS刺激后PDPN的表達(dá)比靜態(tài)細(xì)胞上調(diào)約3倍，蛋白質(zhì)水平顯著增加約6倍。然后又在體內(nèi)PCL后分析了PDPN在血管內(nèi)膜和培養(yǎng)基中的表達(dá)，結(jié)果顯示，d-flow刺激2天后，PDPN的表達(dá)比對照RCA上調(diào)約6倍。進(jìn)一步分析顯示，PDPN在d-flow刺激的F4/80+ 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)。

為了檢查單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞PDPN是否通過d-flow介導(dǎo)血小板和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞內(nèi)皮下沉積，使用已建立的小鼠模型Pdpnfl/fl 和 LysM-cre。相比Pdpn敲除小鼠，轉(zhuǎn)基因 LysM-cre小鼠顯著降低單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的PDPN蛋白水平。PCL 后2天 LCA 中，Mye Pdpn-/- 小鼠血小板和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的內(nèi)膜沉積減少，表明單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞PDPN在體內(nèi)通過d-flow介導(dǎo)內(nèi)皮下血小板和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的積聚。

然后進(jìn)一步確定了敲除血小板 CLEC-2 是否會減少動脈粥樣硬化，通過骨髓移植建立血小板CLEC-2缺失嵌合體Ldlr-/- 小鼠，接受PCL并用HFD喂養(yǎng)3周。結(jié)果顯示，在Plt Clec2-/- 移植的Ldlr-/- 小鼠中斑塊面積與血管腔面積的之比和巨噬細(xì)胞的沉積量分別減少了55.81%（圖3 A、B）和41.59%（圖3 A、C）。這些結(jié)果表明，血小板 CLEC-2 缺失可能是通過抑制血小板和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞內(nèi)皮下沉積來減少d-flow 形成的動脈粥樣硬化斑塊。

圖3 血小板CLEC-2缺失可減弱d-flow誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化斑塊形成。

圖4 圖形概要

研究揭示了一種響應(yīng)d-flow的新的CLEC-2-依賴性血小板內(nèi)皮下沉積機(jī)制以調(diào)節(jié)血管炎癥。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)血小板通過d-flow在小鼠內(nèi)皮下和動脈粥樣硬化斑塊中沉積，這可能在動脈粥樣硬化開始過程中單核細(xì)胞的募集和遷移中起關(guān)鍵作用。這些數(shù)據(jù)擴(kuò)展了我們對動脈粥樣硬化早期事件的了解，并揭示了血小板對d-flow 誘導(dǎo)的血管炎癥和動脈粥樣硬化的重要性。

參考文獻(xiàn)：Tang C, Wang L, Sheng Y, Zheng Z, Xie Z, Wu F, You T, Ren L, Xia L, Ruan C, Zhu L. CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice. Theranostics. 2021 Oct 3;11(20):9791-9804. doi: 10.7150/thno.64601. PMID: 34815786; PMCID: PMC8581433.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815786/

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