冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）是冠心病心肌缺血的有效治療手段之一，自體大隱靜脈（SVG）移植仍是現(xiàn)今CABG中最常用的旁路血管。然而，越來越多的證據(jù)表明，由于靜脈橋平滑肌細(xì)胞（SMCs）的異常增殖、遷移，導(dǎo)致血管不良重塑、新生內(nèi)膜進(jìn)行性增厚和再狹窄，嚴(yán)重影響了靜脈橋的長期通暢率和靜脈移植的失敗。

據(jù)報道，生長因子和機(jī)械應(yīng)力可以將靜脈SMCs的表型從靜止的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨仍鲋澈秃铣傻谋硇汀Ｑ芯勘砻�，靜脈移入動脈循環(huán)后，靜脈SMCs會立即暴露于血管壁隨動脈血壓周期節(jié)律性變形引起的動脈周期性張應(yīng)變下。盡管相關(guān)研究表明動脈機(jī)械拉伸在新內(nèi)膜增生和靜脈移植失敗中起重要作用，但其分子機(jī)制仍遠(yuǎn)未完全了解。

Lamtor1（也稱為p18）是一種特異定位于晚期內(nèi)小體/溶酶體表面的膜蛋白，在溶酶體表面上激活雷帕霉素復(fù)合物1的哺乳動物靶標(biāo)（mTORC1），并在隨后調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。mTOR信號被機(jī)械拉伸和初級纖毛激活，初級纖毛是一種重要的機(jī)械傳感器。然而，mTORC1對機(jī)械刺激的反應(yīng)機(jī)制尚不清楚，Lamtor1 是否具有機(jī)械反應(yīng)性，調(diào)節(jié) mTOR 信號的激活，以及它們在靜脈移植后內(nèi)膜增生中靜脈 SMCs 的去分化和增殖中的機(jī)械生物學(xué)作用也未知。

在上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院力學(xué)生物學(xué)研究所、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院小兒外科、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科團(tuán)隊的一項研究中，采用體內(nèi)“cuff”技術(shù)的靜脈移植動物模型和體外應(yīng)變加載系統(tǒng)，研究了動脈周期性張應(yīng)變對Lamtor1表達(dá)和靜脈SMC分化的影響。全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)分析提示circSlc8a1可能作為miR-20a-5p的海綿靶向Lamtor1。基于SMC特異性Lamtor1敲除（KO）小鼠，還進(jìn)一步研究了Lamtor1和相關(guān)非編碼RNA（ncRNAs）是否可以提供新的潛在治療靶點(diǎn)，以防止內(nèi)膜形成和靜脈移植失敗。具體內(nèi)容發(fā)表在 Theranostics期刊題為“Arterial cyclic stretch regulates Lamtor1 and promotes neointimal hyperplasia via circSlc8a1/miR-20a-5p axis in vein grafts”。
 

首先，利用“cuff”技術(shù)構(gòu)建小鼠靜脈移植模型，模擬臨床搭橋手術(shù)，并檢測小鼠移植靜脈中的新生內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)移植1周后新生內(nèi)膜明顯增厚，增生面積明顯增加。

為了確定Lamtor1在內(nèi)膜形成中的作用，檢查了靜脈移植后Lamtor1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)移植靜脈中的Lamtor1顯著增加，且在新生內(nèi)膜區(qū)表達(dá)急劇增加。增加的 Lamtor1 主要與 α-SMA 共定位，表明其在靜脈 SMCs 中的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。有趣的是，mTORC1的表達(dá)也上調(diào)。

之前揭示了內(nèi)膜增生中靜脈SMCs的異常增殖，在這里，通過Western blot分析了靜脈SMCs的表型轉(zhuǎn)化，這是增殖的基本步驟。結(jié)果表明，靜脈移植物中α-SMA、鈣調(diào)蛋白和SM22的表達(dá)均受到抑制。

這些數(shù)據(jù)表明，靜脈移植到動脈循環(huán)后，Lamtor1 表達(dá)增加，并伴有 mTORC1 激活，以及靜脈 SMCs 的去分化和增殖。這些過程可能參與靜脈移植后的新內(nèi)膜增生。

接下來，為了進(jìn)一步了解靜脈移植中 Lamtor1 調(diào)控的機(jī)制，對移植靜脈和自體靜脈對照進(jìn)行了 RNA-seq。結(jié)果顯示，有86個差異表達(dá)的miRNAs預(yù)測了與Lamtor1的結(jié)合位點(diǎn)，其中52個miRNAs在移植靜脈中與自體對照組相比下調(diào)（圖1 A）。

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫，miR-17-92簇和miR-29簇被預(yù)測參與Lamtor1的調(diào)控（圖1 B），這兩個miRNA簇與Lamtor1 3'-UTR結(jié)合的預(yù)測種子區(qū)域如圖所示圖1 B。然后進(jìn)一步驗證miR-17-92簇和miR-29簇的差異表達(dá)，結(jié)果表明，除miR-20b-5p外，移植靜脈中miR-17-92簇和miR-29簇均被顯著抑制（圖1 C）。

RNA-seq還顯示，移植靜脈中有8個circRNAs上調(diào)，4個circRNAs下調(diào)（圖1 D）。經(jīng)過驗證這些候選circRNAs的表達(dá)，circSlc8a1是移植靜脈中上調(diào)最顯著的（圖1 E），并且是人、小鼠和大鼠中唯一保守的circRNA（圖1 F）。因此，接下來的研究集中在circSlc8a1上。

FISH結(jié)果顯示，陽性circSlc8a1染色和SMA陽性細(xì)胞均主要在體內(nèi)新生內(nèi)膜中表達(dá)（圖1 G）。在培養(yǎng)的靜脈SMCs中，circSlc8a1與細(xì)胞質(zhì)中的α-SMA共定位（圖1 H），這也表明了miR海綿的潛在作用。

圖1 CircSlc8a1 作為 miR-17-92 的海綿，促進(jìn)了 Lamtor1 的表達(dá)。

然后通過特異性敲低circSlc8a1的表達(dá)研究其在靜脈SMCs增殖和去分化中的作用。結(jié)果顯示，敲低circSlc8a1可降低靜脈SMCs的增殖，靜脈SMC分化標(biāo)志物α-SMA、鈣調(diào)蛋白和SM22的表達(dá)顯著升高，且circSlc8a1 的下調(diào)也抑制了 Lamtor1 的表達(dá)。

進(jìn)一步確定與circSlc8a1結(jié)合的潛在miRNAs，發(fā)現(xiàn)circSlc8a1和miR-20a-5p在Ago2沉淀的復(fù)合物中顯著富集。Western blot分析表明，circSlc8a1敲低抑制Lamtor1表達(dá)并促進(jìn)靜脈SMC分化，而同時轉(zhuǎn)染miR-20a-5p可逆轉(zhuǎn)這些作用。此外，miR-20a-5p沉默消除了circSlc8a1對Lamtor1蛋白表達(dá)的抑制作用。circSlca81特異性siRNA抑制SMCs增殖，而miR-20a-5p抑制消除了circSlc8a阻斷的抑制作用。

此外，實驗還確定了 Lamtor1 的效應(yīng)子 mTORC1 是否有助于靜脈 SMC 去分化。雷帕霉素（mTORC1特異性抑制劑，可誘導(dǎo)靜脈SMC分化）和Lamtor 1特異性siRNA增加了收縮標(biāo)志物的表達(dá)，包括α-SMA、鈣調(diào)蛋白和SM22，并抑制了增殖。為了驗證 Lamtor1 或 cirSlc8a1 是否通過 mTORC1 參與 SMC 去分化，用亮氨酸激活 mTORC1，結(jié)果顯示，在mTORC1激活過程中，α-SMA、鈣調(diào)蛋白和SM1等收縮標(biāo)志物的表達(dá)降低，而同時敲低Lamtor1或circSlc8a1的表達(dá)可增加α-SMA、鈣調(diào)蛋白和SM22的表達(dá)。

這些結(jié)果驗證了circSlc8a1和miR-20a-5p在靜脈SMCs中的直接相互作用，表明circSlc8a1作為miR-20a-5p海綿，正向調(diào)控靜脈SMCs中Lamtor1的表達(dá)。

進(jìn)一步地，實驗研究了體外機(jī)械周期性應(yīng)變（10%，1.25 Hz，6h，10h，24h）是否調(diào)節(jié)了靜脈SMCs中circSlc8a1/miR-20a-5p/Lamtor1的表達(dá)（圖2 A）。

與靜態(tài)對照相比，10% 周期性張應(yīng)變顯著提高了circSlc8a1的表達(dá)（圖2 B），但在6h并持續(xù)到24h時降低了miR-20a-5p表達(dá)（圖2 C）。進(jìn)一步檢測Lamtor1的表達(dá)和mTORC1信號的活性，發(fā)現(xiàn)周期性張應(yīng)變在6h和12h點(diǎn)顯著上調(diào)Lamtor1表達(dá)（圖2 D），并刺激mTORC1、4EBP1和p70S6K的磷酸化（圖2E）。

然后檢測 Lamtor1 是否參與了周期性張應(yīng)變對靜脈 SMC 的去分化和增殖，發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)對照相比，應(yīng)變誘導(dǎo)的BrdU摻入量為1.7倍（圖2 F），并降低靜脈SMC收縮標(biāo)志物的表達(dá)（圖2 G）。而Lamtor1 siRNA逆轉(zhuǎn)了機(jī)械應(yīng)變對靜脈SMC增殖的影響（圖2 F）和去分化（圖2 G、H）。

此外，還檢測了應(yīng)變是否通過circSlc1a8調(diào)節(jié)Lamtor1的表達(dá)并促進(jìn)靜脈增殖和去分化。通過敲低circSlc8a1，可以逆轉(zhuǎn)機(jī)械應(yīng)變誘導(dǎo)的增殖增加（圖2 I）和收縮標(biāo)記物表達(dá)的減少（圖2 J）。同時，circSlc8a1敲低逆轉(zhuǎn)了機(jī)械應(yīng)變誘導(dǎo)的靜脈SMC中Lamtor1表達(dá)的增加（圖2 J）。

這些結(jié)果表明，動脈機(jī)械張應(yīng)變誘導(dǎo)circSlc8a1和隨后的Lamtor1的表達(dá)，參與靜脈SMCs的去分化和增殖，并可能參與了靜脈移植過程中的血管重塑。

圖2 動脈機(jī)械拉伸上調(diào) circSlc8a1 和 Lamtor1。

最后，實驗試圖確定circSlc8a1在體內(nèi)新生內(nèi)膜形成中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)CircSlc8a1敲低可顯著減弱移植靜脈中新生內(nèi)膜的形成。Western blot和免疫染色結(jié)果顯示，circSlc1a8敲低組移植靜脈中Lamtor1蛋白水平降低，mTORC1和底物（包括p70S6K和4EBP1）的磷酸化也顯著減弱，并促進(jìn)靜脈SMC的分化。

然后接著評估了 Lamtor1 在移植靜脈新生內(nèi)膜形成中的作用。通過生成 SMC 特異性 Lamtor1 KO 小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠靜脈介質(zhì)層中Lamtor1的表達(dá)被消除（圖3 A、C），在1周靜脈移植物中顯示出內(nèi)膜面積和內(nèi)膜與中膜比率的顯著降低（圖3 B）。然后研究了 SMCs 中 Lamtor1 的特異性缺失是否抑制了體內(nèi) mTORC1 的活性。免疫染色顯示，小鼠中移植靜脈的p70S6K磷酸化顯著降低（圖3 D），收縮蛋白的表達(dá)升高（圖3 E）。

這些數(shù)據(jù)表明，體內(nèi) SMCs 中 Lamtor1 的特異性 KO 減弱了 mTORC1 信號的激活和靜脈 SMC 的去分化，這也有助于搭橋手術(shù)后新生內(nèi)膜的形成。

圖3 SMC 中 Lamtor1 的消除減弱了靜脈移植手術(shù)誘導(dǎo)的新內(nèi)膜形成。

圖4 圖形概要

總之，該研究表明，Lamtor1 通過激活 mTORC1 信號通路并誘導(dǎo)靜脈 SMCs 的去分化和增殖來誘導(dǎo)靜脈移植后新生內(nèi)膜增生。CircSlc8a1 響應(yīng)動脈周期性張應(yīng)變，充當(dāng) miR-20a-5p 的海綿，隨后調(diào)節(jié) Lamtor1 的表達(dá)。敲低 Lamtor1 或 circSlc8a1 可減輕靜脈移植中的內(nèi)膜增生。因此，包括circSlc8a1和Lamtor1在內(nèi)的這些機(jī)械反應(yīng)分子可能為人自體靜脈移植手術(shù)后的內(nèi)膜增生提供潛在的治療靶點(diǎn)。盡管基于高度的同源性和保守性，體內(nèi)和體外動物模型研究為CABG術(shù)后內(nèi)膜形成的診斷和治療提供了重要建議，但circSlc8a1/miR-20a-5p軸的臨床實驗在進(jìn)一步的研究中仍然至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Liu JT, Yao QP, Chen Y, Lv F, Liu Z, Bao H, Han Y, Zhang ML, Jiang ZL, Qi YX. Arterial cyclic stretch regulates Lamtor1 and promotes neointimal hyperplasia via circSlc8a1/miR-20a-5p axis in vein grafts. Theranostics. 2022 Jun 21;12(11):4851-4865. doi: 10.7150/thno.69551. PMID: 35836818; PMCID: PMC9274756.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35836818/

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