動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要發(fā)生在動(dòng)脈的分支和彎曲處，血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）暴露于低剪切應(yīng)力和振蕩剪切應(yīng)力。分叉和彎曲處的血流紊亂會(huì)促發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，擾動(dòng)流上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子和趨化因子的表達(dá)，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和滯留。因此，靶向由血流紊亂或其他動(dòng)脈粥樣硬化驅(qū)動(dòng)因素誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥可對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生有益影響。

Yes-associated protein（YAP）和具有PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TAZ）的轉(zhuǎn)錄共激活因子是Hippo通路的主要下游效應(yīng)因子。據(jù)報(bào)道，YAP和TAZ與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，它們整合機(jī)械信號(hào)以調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程。研究表明，層流剪切應(yīng)力通過整合素-Gα13-RhoA-YAP/TAZ軸抑制內(nèi)皮活化和動(dòng)脈粥樣硬化。相反，據(jù)報(bào)道，振蕩剪切應(yīng)力通過整合素α5β1/c-Abl激活YAP，從而加重內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化。這些發(fā)現(xiàn)表明，YAP有望作為動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)。因此，研究的目標(biāo)是尋找抑制YAP活性的藥物或化合物。

在香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院、香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系課題團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，將抗精神病藥物硫利達(dá)嗪（Thioridazine）確定為一種有效的YAP抑制劑。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，硫利達(dá)嗪抑制了紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，此外，硫利達(dá)嗪的給藥在兩種小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中發(fā)揮了抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。該研究還為硫利達(dá)嗪抑制RhoA調(diào)節(jié)YAP活性的潛在機(jī)制提供了新的見解。這項(xiàng)研究開辟了將硫利達(dá)嗪重新用于干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的可能性。具體內(nèi)容發(fā)表在Acta Pharmacologica Sinica 期刊題為“Thioridazine protects against disturbed flow-induced atherosclerosis by inhibiting RhoA/YAP-mediated endothelial inflammation”。

首先，為了尋找新的YAP抑制劑，研究人員建立了一個(gè)基于熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的藥物篩選平臺(tái)，通過從FDA藥物庫(kù)中篩選小分子化合物，發(fā)現(xiàn)抗精神病藥物硫利達(dá)嗪（10 μM）可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的YAP活性。同時(shí)，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，10 μM的硫利達(dá)嗪對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力沒有明顯的毒性作用，而且促進(jìn)了YAPS127的磷酸化。因此將其確定為一種新的YAP抑制劑。

為了進(jìn)一步探討硫利達(dá)嗪如何影響HUVECs，分離了硫利達(dá)嗪處理的HUVECS的總RNA用于RNA測(cè)序。KEGG富集分析證實(shí)硫利達(dá)嗪調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的Hippo通路。此外，GO和GSEA分析顯示，硫利達(dá)嗪處理與機(jī)械刺激和內(nèi)皮活化有關(guān)。GAD疾病分析顯示，差異表達(dá)基因與包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的心血管疾病顯著相關(guān)，表明硫利達(dá)嗪可以用作一種抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物。因此，RNA-seq分析提供了硫利達(dá)嗪可能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受生物力學(xué)刺激誘導(dǎo)的炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化形成的線索。

接下來，為了研究硫利達(dá)嗪是否抑制機(jī)械刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮活化，對(duì) ApoE KO 小鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行了部分結(jié)扎以誘導(dǎo)擾動(dòng)流（圖1 a）。免疫熒光染色顯示，硫利達(dá)嗪抑制了暴露于擾動(dòng)流的內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1的表達(dá)（圖1 b）。同時(shí)，應(yīng)用平行平板系統(tǒng)來模擬體外擾動(dòng)流（OSS，0.05 ± 0.4 Pa，1 Hz），發(fā)現(xiàn)硫利達(dá)嗪顯著抑制OSS誘導(dǎo)的HUVECs促炎基因的表達(dá)（圖1 d），且顯著阻礙了OSS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附（圖1 e、f）。為了進(jìn)一步探討硫利達(dá)嗪是否通過抑制 YAP 抑制內(nèi)皮活化，用組成型活性 YAP （CA-YAP）轉(zhuǎn)染 HUVECs，然后施加硫利達(dá)嗪和OSS，結(jié)果表明，CA-YAP的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了硫利達(dá)嗪在暴露于擾動(dòng)流的HUVEC中的抗炎作用。因此，硫利達(dá)嗪主要通過抑制YAP來抑制擾動(dòng)流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。

圖1 硫利達(dá)嗪通過限制YAP活性來抑制紊亂的血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。

既往研究報(bào)道，細(xì)胞外刺激（如剪切應(yīng)力）通過小GTPase RhoA調(diào)節(jié)YAP活性。上述RNA-seq數(shù)據(jù)的GO分析表明了硫利達(dá)嗪參與GTPase活性的調(diào)節(jié)。有趣的是，實(shí)驗(yàn)還觀察到用硫利達(dá)嗪處理的HUEVCs的形態(tài)變化。F-肌動(dòng)蛋白染色證實(shí)硫利達(dá)嗪調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白，因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè) RhoA 可能參與了硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)的 Ser127 位點(diǎn) YAP 磷酸化的上調(diào)。GST-RBD拉下試驗(yàn)證實(shí)硫利達(dá)嗪抑制HUVECs中RhoA的活性，且過表達(dá)RhoA 可消除硫利達(dá)嗪誘導(dǎo)的 YAP 磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明，硫利達(dá)嗪通過抑制 RhoA 活性來上調(diào)YAPS127 的磷酸化。

然后，為了確定硫利達(dá)嗪的體內(nèi)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用部分結(jié)扎小鼠模型來誘導(dǎo)擾動(dòng)流（圖1a、2b），將對(duì)照或硫利達(dá)嗪施用于 ApoE−/− 小鼠三周（圖2 a）。結(jié)果表明，硫利達(dá)嗪減輕了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生（圖2 c）。結(jié)扎LCA的H&E和油紅O染色一致證實(shí)了硫利達(dá)嗪的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用（圖2 e-h）。此外，硫利達(dá)嗪抑制RhoA和YAP活性（圖2 i、j），還抑制ApoE−/− 小鼠主動(dòng)脈中YAP靶基因和促炎標(biāo)志物的表達(dá)（圖2 k、l）。

圖2 口服硫利達(dá)嗪抑制ApoE−/− 小鼠部分結(jié)扎誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。

最后，為了進(jìn)一步研究硫利達(dá)嗪的作用，實(shí)驗(yàn)使用了另一種小鼠模型，其中動(dòng)脈粥樣硬化主要?dú)w因于高膽固醇飲食引發(fā)的高脂血癥（圖3 a）。油紅O染色證實(shí)硫利達(dá)嗪延緩了ApoE−/− 小鼠主動(dòng)脈斑塊的形成（圖3 b、c）。與主動(dòng)脈表面染色結(jié)果一致，主動(dòng)脈根部的H&E和油紅O染色顯示，與對(duì)照組相比，硫利達(dá)嗪處理減少了斑塊面積（圖3 e-h）。F4/80 免疫熒光染色表明，硫利達(dá)嗪可減少巨噬細(xì)胞向主動(dòng)脈的浸潤(rùn)（圖3 d）。值得注意的是，硫利達(dá)嗪不會(huì)引起脂質(zhì)譜（圖3 i）和體重的改變（圖3 j），表明硫利達(dá)嗪的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用與脂質(zhì)無關(guān)。

圖3 長(zhǎng)期硫利達(dá)嗪處理減輕了ApoE−/−小鼠中高膽固醇飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。

圖4 將硫利達(dá)嗪重新用于抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的示意圖。通過藥物篩選，硫利達(dá)嗪被確定為一種有效的YAP抑制劑。硫利達(dá)嗪通過抑制 RhoA-YAP 軸抑制內(nèi)皮活化和動(dòng)脈粥樣硬化形成。

綜上所述，該研究顯示，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的臨床藥物硫利達(dá)嗪通過RhoA-YAP信號(hào)通路抑制內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化形成。作為一種新型的YAP抑制劑，硫利達(dá)嗪在治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病方面可能需要進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

參考文獻(xiàn)：Jiang MC, Ding HY, Huang YH, Cheng CK, Lau CW, Xia Y, Yao XQ, Wang L, Huang Y. Thioridazine protects against disturbed flow-induced atherosclerosis by inhibiting RhoA/YAP-mediated endothelial inflammation. Acta Pharmacol Sin. 2023 Oct;44(10):1977-1988. doi: 10.1038/s41401-023-01102-w. Epub 2023 May 22. PMID: 37217602; PMCID: PMC10545737.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37217602/

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