結(jié)腸癌是成人癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、KRAS 或 BRAF基因中存在激活突變和/或 T 細(xì)胞浸潤(rùn)等特征均顯示與預(yù)后和/或治療反應(yīng)相關(guān)。免疫治療的成功取決于免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)以及來(lái)自影響免疫細(xì)胞分化和功能的腫瘤微環(huán)境(TME)的信號(hào)。TME 由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)組成,在確定腫瘤免疫細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用。特別是CAFs,促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生,進(jìn)展,轉(zhuǎn)移形成和治療耐藥性。當(dāng)被腫瘤細(xì)胞激活時(shí),CAFs 可能反過(guò)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性行為。此外,CAFs 有助于免疫抑制性 TME 的產(chǎn)生。從功能上講,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的持續(xù)沉積是 CAF 介導(dǎo)的關(guān)鍵特征,可影響侵襲性腫瘤細(xì)胞行為和免疫抑制的多個(gè)方面。
在結(jié)腸癌中,“間充質(zhì)型”共識(shí)分子亞型4(CMS4)的特征是 CAF 含量高和反映血管生成、炎癥和免疫抑制的基因表達(dá)程序。盡管 CMS4 MSI-L 結(jié)腸癌具有免疫抑制性質(zhì),但已從此類腫瘤中分離出腫瘤特異性新抗原反應(yīng)性 T 細(xì)胞。因此,提高 CMS4 結(jié)腸癌中腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞的活性可能是一種很有前景的治療策略。新型治療策略的設(shè)計(jì)和測(cè)試需要用于研究CMS4(富含CAF)結(jié)腸癌的模型系統(tǒng)。為了揭示腫瘤細(xì)胞和CAFs之間的相互作用如何決定腫瘤行為,需要基于類器官的模型系統(tǒng),其中兩種細(xì)胞類型以可重復(fù)和穩(wěn)健的方式共培養(yǎng)。
在荷蘭烏得勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心以及鹿特丹伊拉斯謨大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究課題組的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,該團(tuán)隊(duì)提出了結(jié)腸癌類器官和CAFs在高度標(biāo)準(zhǔn)化的無(wú)血清培養(yǎng)基和優(yōu)化的ECM中的長(zhǎng)期共培養(yǎng)模型。在這些條件下,腫瘤細(xì)胞和CAFs自發(fā)地組織成上層結(jié)構(gòu),同時(shí)使ECM變硬和收縮。上皮腺結(jié)構(gòu)與CAF軌道直接接觸,與患者結(jié)腸腫瘤的組織學(xué)非常相似。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進(jìn)一步證明了共培養(yǎng)誘導(dǎo)的臨床相關(guān)腫瘤細(xì)胞和 CAF 表型的產(chǎn)生。兩種細(xì)胞類型都需要產(chǎn)生抑制T細(xì)胞增殖的免疫抑制環(huán)境。具體內(nèi)容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Co-cultures of colon cancer cells and cancer-associated fibroblasts recapitulate the aggressive features of mesenchymal-like colon cancer”。
在共培養(yǎng)模型中,首先將小類器官接種在含有基質(zhì)膠和膠原蛋白I 的共培養(yǎng)基質(zhì)中,然后在共培養(yǎng)基中加入CAFs(圖1A)。在最初的2-3天內(nèi),CAFs在含有類器官的基質(zhì)液滴周圍組織成一個(gè)連續(xù)的圓圈(圖1 B、C)。在液滴內(nèi),CAFs組織成基質(zhì)軌跡,同時(shí),類器官沿著這些CAFs軌跡重組。最終,所有單獨(dú)的類器官融合成一個(gè)圍繞 CAF 軌道的單個(gè)實(shí)體 (圖1 D),形成肉眼可見的“微型腫瘤”(圖1 E)。這些數(shù)據(jù)表明,在優(yōu)化條件下與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)CAFs會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的ECM重組和類似腫瘤組織的上層結(jié)構(gòu)的組裝。目前尚不清楚是什么原因?qū)е铝思?xì)胞重組。
圖1 腫瘤細(xì)胞和CAFs自發(fā)重組成宏觀微型腫瘤。
接下來(lái),實(shí)驗(yàn)旨在從機(jī)制上深入了解 CAFs 和腫瘤細(xì)胞如何相互影響彼此的表型以誘導(dǎo) ECM 重塑和細(xì)胞重組。為此,通過(guò)FACS分選對(duì)單培養(yǎng)(CAF-2d、CAF-3d、類器官)和共培養(yǎng)(CAF/類器官)分離的兩種細(xì)胞類型進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序。總共分析了 949 個(gè)細(xì)胞,確定了3 個(gè)腫瘤細(xì)胞群(clusters 1-3)和 3 個(gè)CAF 群(clusters 4-6)。腫瘤細(xì)胞與 CAFs 共培養(yǎng)導(dǎo)致 cluster-2 細(xì)胞減少,而 cluster-3 細(xì)胞強(qiáng)烈擴(kuò)增。為了深入了解不同腫瘤細(xì)胞群和CAFs之間的表型差異,進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。Cluster-1 腫瘤細(xì)胞的特征是缺氧和糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),Cluster-2由95%的單培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞組成,增殖相關(guān)基因表達(dá)最高,Cluster-3 腫瘤細(xì)胞主要由共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞組成,上皮基因(KRT19、EPCAM、CDH1)表達(dá)較低,間充質(zhì)基因(SPARC、TIMP1、VIM、MMP2)和基因集(Hallmark EMT)表達(dá)較高,反映了(部分)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)。此外,CMS4 識(shí)別基因集(CMS2 RF)(主要由 CAF 表達(dá)的基因組成)在 Cluster-3 中表達(dá)水平顯著更高。這些分析表明,共培養(yǎng)中腫瘤細(xì)胞和 CAFs 之間的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變,從上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?間充質(zhì)混合狀態(tài),如在 CMS4 結(jié)腸癌中觀察到的那樣。
然后分析在單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中生長(zhǎng)的CAFs之間的表型差異。Cluster 4 從單一培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成,Cluster 6 從共培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成,Cluster 5 由來(lái)自單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物的 CAF 組成(圖2 A)。差異基因表達(dá)分析顯示,Cluster 6 中多種細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)發(fā)生了變化,包括COL1A1的下調(diào),COL4A1和COL4A的上調(diào)(圖2 B)。CAFs表達(dá)了非常高水平的膠原交聯(lián)酶LOX和膠原裂解酶MMP1。使用免疫熒光分析表明CAF產(chǎn)生的膠原蛋白-4形成了與腫瘤細(xì)胞相互作用的基底膜狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4 C)。此外,與單培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)CAFs中反映缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子1-α靶點(diǎn)的基因集顯著更高(圖2 D),進(jìn)一步的分析表明,與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)了 CAF 代謝的重大轉(zhuǎn)變,參與糖酵解的基因表達(dá)增加(圖2 E),免疫熒光分析表明共培養(yǎng)CAFs中LDHA和 GAPDH 的表達(dá)顯著升高(圖2 F、G)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明,共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。
圖2 共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。
目前根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和結(jié)直腸癌細(xì)胞的異質(zhì)性對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行分型,定義了四種不同的結(jié)直腸癌亞型(CMS1-CMS4)。為了研究單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的 CAF 表型是否與人類結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的 CAF 表型相似,實(shí)驗(yàn)利用了來(lái)自 29 名患者的原發(fā)性結(jié)腸腫瘤的大型單細(xì)胞 RNA 序列數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)表明,共培養(yǎng)中的 CAFs 類似于在人類CMS1和CMS4結(jié)腸癌中富集的具有缺氧糖酵解表型的CAFs亞群。
上述共培養(yǎng)的幾個(gè)特征先前與癌癥中的免疫抑制有關(guān),包括ECM硬化,缺氧和糖酵解代謝;虮磉_(dá)分析顯示,共培養(yǎng)(Cluster-6)中的CAFs表達(dá)非常高水平的免疫抑制基因,包括CXCL8、PTGS2、TGFB1和VEGFA (圖3 A)。對(duì)單一培養(yǎng)或共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的分析表明,共培養(yǎng)比單一培養(yǎng)通常分泌更高水平的TGFβ1(圖3 B)、VEGFA (圖3 C)和乳酸(圖 3 D、E),這表明產(chǎn)生了潛在的免疫抑制環(huán)境。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與不同CAF系共培養(yǎng)的細(xì)胞中分泌因子的數(shù)量存在差異,例如CR16CAF比LCAF5分泌更高水平的TGFB1,這反映了CAFs的異質(zhì)性。最后,為了直接測(cè)試免疫抑制潛力,分析了條件培養(yǎng)基對(duì)從四個(gè)不同供體中分離的 T 細(xì)胞活化的影響。從CAF或腫瘤細(xì)胞單培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基分別對(duì)T細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用和有中等抑制作用。相比之下,從 CAF/腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基在所有四種情況下均有效抑制 T 細(xì)胞增殖(圖3 F、G)。這些數(shù)據(jù)表明,CAFs和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)引起的部分表型變化,導(dǎo)致了免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。
圖3 共培養(yǎng)中免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。
一般來(lái)說(shuō),特異性器官微環(huán)境對(duì)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的免疫環(huán)境的影響及其對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)是免疫腫瘤學(xué)研究的一個(gè)重要主題。該報(bào)告中開發(fā)的共培養(yǎng)模型系統(tǒng)通過(guò)合理添加特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分,可以開始對(duì)器官特異性微環(huán)境進(jìn)行建模,以評(píng)估它們對(duì)T細(xì)胞行為的影響。類器官和永生化 CAFs 的共培養(yǎng)概括了侵襲性間充質(zhì)型人結(jié)直腸癌的組織學(xué)、生理學(xué)和免疫抑制特征。該模型可用于研究免疫抑制的機(jī)制,并測(cè)試針對(duì)CAFs和腫瘤細(xì)胞之間串?dāng)_的治療策略,也可以進(jìn)一步修改以代表不同的結(jié)腸癌亞型和(器官特異性)微環(huán)境。最終,這將有助于開發(fā)涉及免疫療法的新型聯(lián)合治療策略。
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原文鏈接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37261365/
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