單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)助力細(xì)菌與宿主粘附調(diào)控新機(jī)制
近日，北京大學(xué)工學(xué)院黃建永課題組在Nature Communications上在線發(fā)表了題為“Geometric constraint-triggered collagen expression mediates bacterial-host adhesion”的研究論文。本文基于多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM的單細(xì)胞力譜技術(shù)（Single cell force spectrum，SCFS）研究細(xì)菌與宿主細(xì)胞界面力學(xué)相互作用，并進(jìn)一步定量表征了細(xì)菌與宿主細(xì)胞間的特異性粘附力，建立了細(xì)菌與宿主細(xì)胞單層相互作用的力-化學(xué)耦合模型，從力學(xué)生物學(xué)視角揭示了空間幾何約束誘導(dǎo)細(xì)菌與宿主細(xì)胞異質(zhì)性粘附的時(shí)空動(dòng)態(tài)規(guī)律，在此研究基礎(chǔ)上得出，有效抑制宿主細(xì)胞表面特異性粘附受體的表達(dá)可能會(huì)最大限度地減少細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的生物力學(xué)粘附，從而促進(jìn)細(xì)菌的抗生素治療。這一點(diǎn)對(duì)于提高抗生素效力，避免臨床誤用具有至關(guān)重要的意義。
文中所使用的多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM的單細(xì)胞力譜技術(shù)，可在單細(xì)胞水平上提供高質(zhì)量的力學(xué)數(shù)據(jù)，具有操作簡(jiǎn)單、適用細(xì)胞種類多、通量高、力學(xué)范圍寬等優(yōu)勢(shì)，為本文生物力學(xué)的研究提供了關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支撐。
文中所使用的多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM的單細(xì)胞力譜技術(shù)，可在單細(xì)胞水平上提供高質(zhì)量的力學(xué)數(shù)據(jù)，具有操作簡(jiǎn)單、適用細(xì)胞種類多、通量高、力學(xué)范圍寬等優(yōu)勢(shì)，為本文生物力學(xué)的研究提供了關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支撐。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM
【研究背景】
細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的物理接觸和隨后的粘附是細(xì)菌感染的先決條件，由于高致病性細(xì)菌和耐藥細(xì)菌的存在，細(xì)菌感染已成為世界范圍內(nèi)對(duì)人類健康嚴(yán)重的威脅之一。在細(xì)菌-宿主相互作用中，細(xì)菌首先借助于各種物理化學(xué)因子到達(dá)宿主表面，可能通過粘附素和細(xì)胞受體實(shí)現(xiàn)特異性粘附。一些細(xì)菌甚至在隨后的過程中內(nèi)化到宿主細(xì)胞中，從而保護(hù)它們免受宿主免疫系統(tǒng)和抗生素的攻擊。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)菌和宿主細(xì)胞的物理微環(huán)境，包括但不限于界面粘附力、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)剛度和幾何約束，在調(diào)節(jié)它們的功能和行為中起著關(guān)鍵作用，從而影響細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間的各種相互作用。例如，細(xì)菌粘附力作為致病力的一個(gè)重要因素，可以促進(jìn)細(xì)菌毒素的傳播。機(jī)械生物學(xué)的新進(jìn)展已經(jīng)揭示了ECM的剛性通過細(xì)胞骨架重塑調(diào)節(jié)細(xì)菌-宿主相互作用和細(xì)菌內(nèi)化。此外，在傷口愈合、細(xì)胞遷移和腫瘤形成等各種生物過程中普遍存在的宿主細(xì)胞的幾何約束被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞-ECM粘附和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。據(jù)報(bào)道，組織形態(tài)發(fā)生和腫瘤進(jìn)展本質(zhì)上是由細(xì)胞牽引力和細(xì)胞間收縮應(yīng)力之間的競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)的。同樣，細(xì)菌-宿主相互作用涉及復(fù)雜的生物物理相互作用，其中病原體可以操縱宿主細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn)傳播，而宿主細(xì)胞可能改變其防御策略以消除病原體。盡管在細(xì)菌宿主中存在著復(fù)雜的機(jī)械感應(yīng)和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用與周圍微環(huán)境，宿主細(xì)胞的空間幾何約束是否以及如何觸發(fā)它們的功能反應(yīng)來調(diào)節(jié)與致病菌的物理相互作用仍然是一個(gè)謎。
【研究結(jié)果】
本文中科研團(tuán)隊(duì)首先建立了一個(gè)典型細(xì)菌的體外模型，如金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，感染上皮細(xì)胞，如IEC-6細(xì)胞(大鼠小腸上皮細(xì)胞系6)和HaCat細(xì)胞(人角化細(xì)胞細(xì)胞系)，借助成熟的微接觸打印技術(shù)，允許致病菌感染生長(zhǎng)在空間受限的細(xì)胞外基質(zhì)上的宿主細(xì)胞單層。作者證明，由于宿主單層上存在二維(2D)幾何約束，細(xì)菌與宿主之間存在顯著的空間異質(zhì)性相互作用。利用基于流體力顯微鏡FluidFM技術(shù)及單細(xì)胞力譜(SCFS)，作者量化了細(xì)菌和幾何限制的宿主單層之間的粘附力，從而揭示了這些力本質(zhì)上是空間位置和基質(zhì)剛度相關(guān)的。利用單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和(MC)模擬，作者進(jìn)一步闡明了由幾何約束觸發(fā)的邊緣效應(yīng)導(dǎo)致的宿主單層中膠原IV的異質(zhì)表達(dá)在調(diào)節(jié)空間異質(zhì)細(xì)菌-宿主粘附中起關(guān)鍵作用。最后，作者發(fā)現(xiàn)膠原IV抑制劑不僅可以有效減少異質(zhì)粘連，而且可以作為抗生素佐劑來增強(qiáng)抗生素效力。
圖1. 利用基于FluidFM的SCFS定量表征單個(gè)細(xì)菌與微圖案宿主細(xì)胞單層之間的粘附力
【研究意義】
生活在幾何受限微環(huán)境中的細(xì)胞普遍存在于各種生理過程中，例如傷口愈合。然而，宿主細(xì)胞的空間幾何約束是否以及如何調(diào)節(jié)細(xì)菌與宿主的相互作用仍不清楚。本文研究團(tuán)隊(duì)揭示了細(xì)菌與空間受限的細(xì)胞單層之間的相互作用表現(xiàn)出強(qiáng)烈的空間異質(zhì)性，細(xì)菌傾向于粘附在受限制的單層外緣附近的這些細(xì)胞上。細(xì)菌粘附力在微圖紋單分子膜邊緣的粘附力可達(dá)75nN，是中心粘附力的3倍，這取決于底層基質(zhì)的剛性。單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)表明，具有顯著邊緣效應(yīng)的IV型膠原在空間上的異質(zhì)表達(dá)與位置依賴性細(xì)菌粘附有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IV型膠原蛋白抑制劑可以作為佐劑來減少細(xì)菌粘附，從而顯著提高抗生素的療效。本文詳盡的工作不僅闡明了空間幾何約束微環(huán)境調(diào)控細(xì)菌-細(xì)胞界面粘附的力學(xué)生物學(xué)機(jī)制，也為抗生素輔劑的篩選和臨床上改善細(xì)菌抗生素治療方案提供了可借鑒的思路和策略。
【研究利器】
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本文中FluidFM技術(shù)被用于對(duì)單細(xì)胞的黏附力進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)細(xì)菌和微球的大小(直徑1 μm, Sigma)，選擇開口(直徑300 nm)和彈簧常數(shù)(0.6 N/m)的FluidFM懸臂探針。懸臂梁靈敏度(S, m/v)用Sader方法標(biāo)定。探針被0.1 mg/ml PLL-g-PEG包被20min，以減少非特異性細(xì)胞結(jié)合，然后在純凈水中洗滌5分鐘。在細(xì)胞力譜實(shí)驗(yàn)中，通過施加負(fù)壓(- 200 mbar)將單個(gè)細(xì)菌緊緊固定在懸臂開口處。然后，帶有單個(gè)細(xì)菌的懸臂梁以1 μm/s的壓電速度接近選定的細(xì)胞，并在達(dá)到設(shè)定值(100 nN)時(shí)暫停30s與細(xì)胞相互作用。最后，以1 μm/s的壓電速度收回懸臂梁，獲得粘附力數(shù)據(jù)。
圖2. 細(xì)菌-宿主細(xì)胞的界面力學(xué)相互作用
FluidFM技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)：
1. 技術(shù)可在單細(xì)胞水平上提供高質(zhì)量的力學(xué)數(shù)據(jù)
2. 技術(shù)具有通量高、力學(xué)范圍寬等優(yōu)勢(shì)，可直接抓取或者壓細(xì)胞。
3. 適用細(xì)胞種類：懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞均可測(cè)量
4. 力學(xué)范圍：nN到μN級(jí)別的細(xì)胞水平的力
5. 操作簡(jiǎn)單：區(qū)別于AFM細(xì)胞力學(xué)測(cè)量，具有簡(jiǎn)便、直接的優(yōu)勢(shì)。
【參考文獻(xiàn)】
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