血流紊亂引起的動脈粥樣硬化會導致內(nèi)皮功能障礙，激活蛋白酶水平，并調(diào)節(jié)動脈基質(zhì)成分，引起血管重塑，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。血管重塑與彈性蛋白層和膠原基質(zhì)降解以及細胞外基質(zhì) （ECM） 的再分布有關(guān)。組織蛋白酶K（CTSK）是肽酶C1家族溶酶體半胱氨酸蛋白酶中最有效的蛋白酶之一，被證實參與動脈粥樣硬化過程中ECM的重新分布。最近，CTSK在人動脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞中表達。已發(fā)現(xiàn)CTSK受氧化型LDL（OxLDL）、細胞因子和振蕩剪切應力的調(diào)控。然而，血流動力學如何傳遞和調(diào)控CTSK表達的分子機制尚不清楚。

作為生物力學傳感器的重要候選者，整合素在將機械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號方面發(fā)揮著核心作用。整合素聚簇促進β亞基的細胞質(zhì)尾部與細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架之間的動態(tài)連接，以形成黏著斑和細胞骨架排列。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3激活原發(fā)性血流誘導的NF-κB通路，并參與早期動脈粥樣硬化炎癥。

為了探討CTSK調(diào)控擾動流（disturbed flow）誘導動脈粥樣硬化形成的分子機制，華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究室（四川）、生物流變科學與技術(shù)教育部重點實驗室（重慶）的聯(lián)合課題組構(gòu)建了小鼠左頸總局部結(jié)扎的方法構(gòu)建在體擾動流模型，探討擾動流誘導的CTSK參與內(nèi)皮炎癥和血管重塑的機制，檢測了αvβ3整合素和CTSK在動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)的表達水平及NF-κB的激活情況。研究結(jié)果表明，CTSK導致血流依賴性內(nèi)皮炎癥和血管重塑，這有望通過靶向整合素αvβ3-細胞骨架來抑制。該研究對動脈粥樣硬化的治療具有新的啟示意義。相關(guān)結(jié)果發(fā)表于Genes & Diseases 雜志題為“Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on Integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway”。
 

首先，研究人員利用經(jīng)典的ApoE-/- 小鼠頸動脈部分結(jié)扎模型建立了擾動流模型（圖1 A），LCA（左頸動脈）和升主動脈（AA）區(qū)域暴露于擾動流，而RCA（右頸動脈）和降主動脈（DA）區(qū)域暴露于穩(wěn)定的層流。ORO染色和H&E 染色證實，小鼠左頸總血管脂質(zhì)沉積增多，直徑增大、內(nèi)膜厚度增加以及彈性蛋白層破裂（圖1 B-G）。這些結(jié)果表明，擾動流會加速ApoE-/- 小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成。

為了排除血清膽固醇水平和脂質(zhì)沉積對血管炎癥和重構(gòu)的影響，實驗使用正常血脂小鼠的部分頸動脈結(jié)扎模型進行體內(nèi)擾動流實驗，檢驗了NF-κB負責流動誘導的細胞炎癥的假設(shè)。結(jié)果在不同流動區(qū)域的ECs中檢測到在NF-κB家族中起關(guān)鍵作用的p65，由體內(nèi)層流區(qū)的細胞質(zhì)易位至 LCA 和 AA 區(qū)域的細胞核中，表明 NF-κB 的激活。qRT-PCR結(jié)果顯示，LCA區(qū)域炎癥相關(guān)mRNA（IL-1β、IL-6、TNF-α和p65）顯著升高。此外，在正常小鼠中，血流紊亂導致新內(nèi)膜增生而無脂質(zhì)沉積，彈性蛋白層斷裂增多。這些結(jié)果表明，在動脈粥樣硬化形成的開始和進展過程中，擾動流引起的血管炎癥和重塑與血清膽固醇水平或動脈壁中的脂質(zhì)沉積無關(guān)。

圖1 血流紊亂會誘發(fā)左頸動脈（LCA）的動脈粥樣硬化和血管重構(gòu)。

據(jù)研究，CTSK可能參與了由擾動流引起的血管重塑和血管炎癥。因此，接下來檢測了CTSK和Col1-A在結(jié)扎ApoE-/- 小鼠中的分布。結(jié)果觀察到 CTSK 和 Col1-A 的共定位，表明 CTSK 可能通過降解 I 型膠原來重塑細胞外基質(zhì)。21 天后，C57BL/6小鼠在擾動流區(qū)域ECs（LCA，AA）中CTSK表達、蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著高于層流區(qū)（RCA，DA）的表達。然后研究了在促動脈粥樣硬化區(qū)域擾動流誘導CTSK的分子過程。在前人研究的基礎(chǔ)上，該研究提出將整合素作為擾動流中的機械介質(zhì)，促進CTSK的表達。因此，實驗使用部分頸動脈結(jié)扎模型在 LCA 和彎曲的AA 中創(chuàng)建擾血流。免疫熒光圖像顯示，C57BL/6小鼠結(jié)扎21 天后LCA和AA的整合素αv和β3水平顯著高于RCA組和DA組。

此外，采用體外剪切力加載裝置在體外產(chǎn)生單向?qū)恿鲬�力（LSS）或擾動剪切應力（DSS），HUVECS暴露于LSS（15 dyn/cm²）或DSS（± 4.5 dyn/cm²）分別持續(xù) 8 小時。與LSS或靜態(tài)對照相比，DSS升高了Ser536位點磷酸化p65的表達水平（圖2 A）。體外研究證實，p65蛋白在DSS誘導的HUVECs中從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核8小時（圖2 B）。強度曲線顯示，DSS條件下p65蛋白和細胞核具有明顯的共定位性（圖2 B）。由于DSS誘導的p65蛋白磷酸化可促進NF-κB活化并導致細胞炎癥，實驗通過qRT-PCR評估了不同流動條件下HUVECs中促炎mRNA的mRNA表達，與LSS或靜態(tài)對照相比，DSS顯著上調(diào)mRNA（IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8）的定量表達（圖2 C）。

通過Western blot檢測CTSK在暴露于不同流動條件的HUVECs中的表達，結(jié)果表明，DSS顯著提高了HUVECs中CTSK的水平（圖2 D），與體內(nèi)模型的結(jié)果一致。qRT-PCR結(jié)果進一步證實，DSS顯著增強了CTSK的mRNA表達（圖2 E）。I型膠原是CTSK的底物，CTSK可使I型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)斷裂。在靜態(tài)對照組和LSS組I型膠原纖維明顯突出，而DSS組的CTSK水平高，I型膠原纖維明顯減少（圖2 F）。這些結(jié)果表明，DSS可以促進CTSK的表達并降解基質(zhì)，最終導致血管重塑。此外，發(fā)現(xiàn)DSS組整合素αv和β3的表達明顯高于LSS組或靜態(tài)對照組（圖2 G）。綜上所述，DSS可誘導內(nèi)皮炎癥和ECM再分布，并伴有高水平的CTSK和整合素αvβ3表達。

圖2 DSS 在體外誘導內(nèi)皮炎癥并增加 CTSK 表達。

進一步地，實驗想要闡明整合素如何介導剪切誘導的動脈粥樣硬化變化。上述結(jié)果表明，DSS誘導p65，在西侖吉肽（整合素αvβ3的特異性抑制劑）和ATN-161（整合素α5β1抑制劑）存在下，可以重新分布到細胞質(zhì)，這表明內(nèi)皮炎癥可以通過抑制整合素完全減弱。通過使用西倫吉肽或ATN-161，可以發(fā)現(xiàn)肌動蛋白纖維沒有明顯差異（圖3 A、B）。

qRT-PCR結(jié)果顯示，DSS組促炎因子（IL-6、TNF-α、ICAM-1、p65和IL-8）的mRNA表達水平顯著低于預阻斷整合素的LSS組（圖3 C）。相比之下，暴露于LSS通過抑制整合素顯著提高CTSK水平（圖3 D）。采用細胞骨架聚合抑制劑latrunculin B（LatB、10μM、12h）探究不同流動條件下整合素誘導的細胞骨架排列和炎癥反應。抑制細胞骨架排列后，肌動蛋白應激紊亂，板足前緣偽足少且短，血流依賴性內(nèi)皮炎癥增強。

使用 IκB/IKK 抑制劑 BAY 11-7085（10 μM、12h），進一步研究了 NF-κB 對暴露于 DSS 或 LSS 的 HUVECs 中 CTSK 表達的影響，可以發(fā)現(xiàn)，DSS通過抑制NF-κB通路的激活顯著降低了CTSK的表達（圖3 E）。這些結(jié)果表明，整合素-細胞骨架介導血流誘導的NF-κB激活和血管重構(gòu)。

圖3 擾動流誘導內(nèi)皮細胞炎癥，具體取決于整合素-NF-κB軸。

基于上述體外研究結(jié)果，細胞表面整合素受體可作為潛在的治療靶點。因此，實驗測試了整合素抑制劑西侖吉肽（5 μg/kg/d）在頸動脈結(jié)扎模型中的抗炎作用。結(jié)果表明，整合素阻斷可以減輕正常血脂小鼠的炎癥和重塑。

最后實驗評估了整合素阻斷在DSS誘導的加速動脈粥樣硬化中的保護特性。西侖吉肽組頸動脈結(jié)扎后高脂血癥小鼠LCA和AA區(qū)域的脂質(zhì)沉積明顯低于二甲基亞砜對照組（圖4 A、B）。同時，免疫熒光圖像顯示，西侖吉肽給藥后動脈粥樣硬化斑塊中CTSK的表達降低（圖4 C）。此外，還發(fā)現(xiàn)整合素的抑制可以降低CTSK和Col1-A的共定位。H&E染色結(jié)果顯示，整合素阻斷可顯著降低結(jié)扎后21 天高脂血癥患者動脈粥樣硬化斑塊的進展和血管平均直徑（圖4 D、E）。此外，與二甲基亞砜對照組相比，西侖吉肽組LCA中彈性蛋白的內(nèi)側(cè)直徑和破裂次數(shù)均減少（圖4 F-H）。這些結(jié)果說明，整合素阻斷可減少擾動流誘導的動脈粥樣硬化。

圖4 整合素阻斷可減少血流紊亂誘發(fā)的動脈粥樣硬化。

總之，該研究的發(fā)現(xiàn)揭示了擾動流導致CTSK表達的增加，并導致內(nèi)皮炎癥和血管重塑，最終導致動脈粥樣硬化，而這取決于整合素 αvβ3-細胞骨架-NF-κB 信號軸。此外，整合素αvβ3-細胞骨架的抑制有望成為血管抗炎和抗動脈粥樣硬化治療的靶點。

參考文獻：Fang F, Feng T, Li J, Zhang H, Wang Q, Chen Y, Wang G, Shen Y, Liu X. Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway. Genes Dis. 2022 Apr 25;10(2):583-595. doi: 10.1016/j.gendis.2022.03.020. PMID: 37223522; PMCID: PMC10201601.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37223522/

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