RT-PCR反應中RNA重難點及解決方案分享
在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
二、常見RNA酶抑制劑:
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
三、注意事項
1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會出太大問題。
3. PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2 濃度、退火溫度能解決的。
四、如何確認RNA的質量
各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考��！
以下兩種方法，相信大家都知道的：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.8-2.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
保溫試驗：
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續(xù)的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了！
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
二、常見RNA酶抑制劑:
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
三、注意事項
1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會出太大問題。
3. PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2 濃度、退火溫度能解決的。
四、如何確認RNA的質量
各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考��！
以下兩種方法，相信大家都知道的：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.8-2.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
保溫試驗：
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續(xù)的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了！
