原創(chuàng)：生物工藝與技術(shù) 文章來源： 生物制品圈

在大規(guī)模生產(chǎn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的過程中，確保其質(zhì)量和多能性以滿足臨床需求面臨著諸多挑戰(zhàn)。iPSC的多能狀態(tài)極為敏感，且對培養(yǎng)基質(zhì)有較強的依賴性。為了實現(xiàn)可放大的干細(xì)胞生物工藝，必須采用能夠?qū)崟r監(jiān)測細(xì)胞分化、生長狀態(tài)及活性的標(biāo)記物。此外，開發(fā)適合的細(xì)胞培養(yǎng)模式，以支持高質(zhì)量的懸浮干細(xì)胞生長，是實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵。本文將綜述在iPSC的誘導(dǎo)、擴(kuò)增和生產(chǎn)過程中，如何通過優(yōu)化培養(yǎng)基、懸浮培養(yǎng)模式和監(jiān)測技術(shù)來維持其質(zhì)量和多能性。

干細(xì)胞生產(chǎn)的最新進(jìn)展以及挑戰(zhàn)

干細(xì)胞療法，包括組織移植和藥物發(fā)現(xiàn)等應(yīng)用，已被廣泛用于治療多種臨床適應(yīng)癥，特別是在腫瘤、心臟病、免疫疾病和神經(jīng)疾病等領(lǐng)域。因此，干細(xì)胞研究的核心目標(biāo)之一是在保持細(xì)胞分化精確控制的同時，優(yōu)化細(xì)胞生長策略。傳統(tǒng)上，胚胎干細(xì)胞（ESC）因其固有的多能性而被視為細(xì)胞治療的理想選擇，這種多能性使得細(xì)胞能夠分化為任何特定的細(xì)胞類型。ESC的發(fā)現(xiàn)為再生醫(yī)學(xué)以及多種病理疾病的治療提供了巨大的潛力。無論干細(xì)胞的來源如何，ESC在增殖過程中必須進(jìn)行自我更新以維持其多能性，同時抑制向特定細(xì)胞類型的分化。

在2007年，Yamanaka及其團(tuán)隊實現(xiàn)了干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一項重大突破，成功地將人類體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有與人類胚胎干細(xì)胞（hESC）相似的基因表達(dá)譜和多能性的細(xì)胞。這些細(xì)胞被命名為人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）。iPSC的產(chǎn)生避免了從胚胎中提取干細(xì)胞所帶來的倫理問題，使其成為研究和臨床應(yīng)用的一個更為有利的平臺。由于其固有的自我更新能力、多能性以及相對較低的免疫原性，iPSC成為一種極具前景的、來源于患者的無限細(xì)胞資源，可用于人類遺傳疾病的建模和毒理學(xué)研究，從而降低了藥物開發(fā)和臨床試驗的總體成本和相關(guān)風(fēng)險。憑借其多方面的能力，iPSC技術(shù)仍然是個性化細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個有前途的科學(xué)工具。

目前，臨床細(xì)胞治療和人類組織再生需要大量（10^8至10^10）符合現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）的臨床級干細(xì)胞。然而，由于多能干細(xì)胞對支持基質(zhì)的依賴以及其多能狀態(tài)的敏感性，將細(xì)胞培養(yǎng)放大到所需規(guī)模仍面臨重大挑戰(zhàn)。在收獲過程中，iPSC的最終質(zhì)量取決于其代謝狀態(tài)；具體而言，維持多能狀態(tài)和自我更新對于生產(chǎn)臨床級iPSC至關(guān)重要。因此，監(jiān)測細(xì)胞分化狀態(tài)、生長狀態(tài)和活性的內(nèi)在標(biāo)記方法對于大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。此外，現(xiàn)有平臺正在不斷優(yōu)化，以滿足cGMP標(biāo)準(zhǔn)，從而有效地將生物工藝放大到臨床生產(chǎn)環(huán)境。本文將重點介紹iPSC細(xì)胞培養(yǎng)方法的最新進(jìn)展，包括培養(yǎng)基、懸浮模式和監(jiān)測技術(shù)，這些方法在一定程度上保持了iPSC的質(zhì)量和多能性，以滿足臨床生產(chǎn)的需求。此外，我們還將探討未來可能提高iPSC生物工藝效率和產(chǎn)量的技術(shù)。

從異質(zhì)細(xì)胞群中分離iPSC

許多信號能夠激活干細(xì)胞分化，因此，細(xì)胞培養(yǎng)條件的微小變化或?qū)��?xì)胞的應(yīng)激可能導(dǎo)致細(xì)胞群體的異質(zhì)性分化。這構(gòu)成了一個嚴(yán)重的安全問題，因為分化細(xì)胞的污染可能在細(xì)胞移植受體中引發(fā)潛在的腫瘤或畸胎瘤形成。然而，干細(xì)胞分化也可能自發(fā)發(fā)生，例如在細(xì)胞外基質(zhì)中長期培養(yǎng)時觀察到的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的情況。為了調(diào)節(jié)這種類型的反應(yīng)并保存用于未來應(yīng)用的多能干細(xì)胞（PSC），已經(jīng)應(yīng)用了分離多能細(xì)胞和分化細(xì)胞的細(xì)胞分選方法。熒光活化細(xì)胞分選（FACS）和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定義的多能性特征分離細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)條件增強多能性標(biāo)記陽性干細(xì)胞的選擇性。對于iPSC，當(dāng)添加四種抑制劑的小分子混合物（SMC4培養(yǎng)基）時，分選后觀察到SSEA4/TRA-1-81陽性iPSC克隆比在傳統(tǒng)重編程培養(yǎng)基中分選的細(xì)胞衍生克隆增加了55倍。盡管FACS是高度自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的，但分選單個細(xì)胞以產(chǎn)生穩(wěn)定的多能細(xì)胞克隆仍然是一項勞動密集型且耗時的工作。因此，能夠產(chǎn)生多能細(xì)胞群體作為池培養(yǎng)的方法是首選的，因為池可以保持多能標(biāo)記物的長期穩(wěn)定表達(dá)。為此，使用細(xì)胞表面標(biāo)記抗體的磁激活細(xì)胞分選（MACS）方法已被用于生成iPSCs池。在這種情況下，用TRA-1-60和SSEA4抗體進(jìn)行一輪異質(zhì)性細(xì)胞池分選后，TRA-1-60和SSEA4陽性細(xì)胞的數(shù)量分別增加了28%和11%。另外幾輪的MACS進(jìn)一步富集了表達(dá)多能性標(biāo)記的細(xì)胞群體。一般來說，MACS是比FACS更好的方法，因為它可以輕松快速地同時在多個樣品上進(jìn)行，同時僅對細(xì)胞施加較小的剪切應(yīng)力。

盡管細(xì)胞分選技術(shù)在基于形態(tài)學(xué)和表面標(biāo)志物表征干細(xì)胞群體方面表現(xiàn)出有效性，但其在分離動物或臨床研究級別的多能干細(xì)胞方面的廣泛應(yīng)用仍受到限制。這主要是由于GMP級抗體的高昂成本以及臨床級FACS設(shè)備和專業(yè)技能的有限可用性。因此，在未來的細(xì)胞治療臨床試驗中，迫切需要開發(fā)可放大的平臺，以生成可靠、均一且安全的臨床級多能干細(xì)胞群體。

最佳iPSC培養(yǎng)基及培養(yǎng)基的開發(fā)

在iPSC擴(kuò)增過程中，確保其質(zhì)量的關(guān)鍵步驟之一是使用經(jīng)過良好表征的材料，其中細(xì)胞培養(yǎng)基和基質(zhì)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞培養(yǎng)基通過提供營養(yǎng)、礦物質(zhì)和pH值的良好平衡，對維持健康且增殖的細(xì)胞至關(guān)重要。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)則作為細(xì)胞粘附和增殖的支撐結(jié)構(gòu)，通常被飼養(yǎng)層細(xì)胞或生長支持因子包裹，以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長。使用完全表征的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對于控制良好的生物工藝過程至關(guān)重要，尤其是對于生產(chǎn)臨床級別的生物樣品。在過去十年中，iPSC培養(yǎng)基配方和基質(zhì)已經(jīng)得到了顯著的發(fā)展，這主要得益于對維持iPSC細(xì)胞系多能性和整體工藝可放大性的信號通路的深入考慮。

在為iPSC設(shè)計培養(yǎng)基時，一種有效的策略是識別多能性依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中涉及的內(nèi)源性生長因子。調(diào)控干細(xì)胞多能性基因表達(dá)的途徑多種多樣，包括轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族激活級聯(lián)、受體酪氨酸激酶信號通路（如堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的下游信號）、以及涉及胰島素樣生長因子（IGF）的途徑等。值得注意的是，維持小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）多能性的蛋白質(zhì)和生長因子（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和白血病抑制因子（LIF））與人類胚胎干細(xì)胞（hESC）不同。多能干細(xì)胞在維持多能性和自我更新方面可能需要不同的生長因子。例如，bFGF已被確定為維持體外hESC自我更新的關(guān)鍵添加物，在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)物中其濃度通常在40 ng/ml到100 ng/ml之間。此外，Wnt/β-catenin信號通路與hPSC的自我更新相關(guān)，盡管單獨添加Wnt3a不足以在沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞的情況下維持未分化的hESC。由于這些代謝研究主要在hESC上進(jìn)行，而非iPSC，因此需要對iPSC進(jìn)行更深入的表征，以便設(shè)計培養(yǎng)基，并考慮每種新細(xì)胞系在臨床應(yīng)用中開發(fā)的獨特要求。

通過提供特定的干性支持因子以及創(chuàng)造富含細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的環(huán)境，基于飼養(yǎng)層細(xì)胞的基質(zhì)可以防止干細(xì)胞自發(fā)分化，并改善ESC和/或iPSC的附著。最常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞是增殖失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），因為它們能夠產(chǎn)生多種對維持多能性至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，如TGF-β1、激活素A、BMP-4和多營養(yǎng)因子（肝素結(jié)合生長因子）等。然而，由于飼養(yǎng)層細(xì)胞的增殖能力有限，經(jīng)過多次傳代后，其支持iPSC多能性的效率會降低，且在分離iPSC過程中存在較高的污染風(fēng)險，這在大規(guī)模生產(chǎn)iPSC時會引發(fā)相關(guān)技術(shù)挑戰(zhàn)。此外，動物源性飼養(yǎng)基質(zhì)可能增加病原體和未知病毒向宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)。因此，iPSC的培養(yǎng)方法主要轉(zhuǎn)向使用ECM蛋白、條件培養(yǎng)基或合成生物材料，以實現(xiàn)無動物成分和無細(xì)胞（稱為“無飼養(yǎng)”）的培養(yǎng)系統(tǒng)。

在過去十年中，隨著培養(yǎng)基技術(shù)的進(jìn)步，iPSC細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)逐步達(dá)到了cGMP標(biāo)準(zhǔn)。最近的研究表明，長期使用動物源性血清和含異源分子的培養(yǎng)基可能會影響細(xì)胞形態(tài)、擴(kuò)增潛力、基因表達(dá)和細(xì)胞因子譜。這促使了無異源成分培養(yǎng)基（XFM）配方的開發(fā)，隨后是無動物源性成分（ACF）培養(yǎng)基，以支持iPSC的擴(kuò)增。在已開發(fā)的ACF培養(yǎng)基中，Essential 8™（Thermo Fisher Scientific）培養(yǎng)基是iPSC培養(yǎng)中使用最廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一，因為它包含了8種對干細(xì)胞增殖至關(guān)重要的成分：DMEM/F12、L-抗壞血酸、磷酸鎂、硒鈉、FGF-2、胰島素、NaHCO3以及轉(zhuǎn)鐵蛋白、TGF-β1或Nodal。

無飼養(yǎng)iPSC擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展為未來的自動化生產(chǎn)提供了可能性。事實上，利用CompacT SelecT™細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在無飼養(yǎng)條件下，大規(guī)模自動化生產(chǎn)未分化的iPSC是可行的。在這種情況下，使用含有Activin A和FGF-2的化學(xué)限定培養(yǎng)基（CDM）進(jìn)行自動傳代的聚體hiPSC能夠保持其特征形態(tài)和多能性標(biāo)記物的表達(dá)。生物材料也被探索作為無飼養(yǎng)iPSC培養(yǎng)系統(tǒng)的增強基質(zhì)。例如，一項研究發(fā)現(xiàn)，具有最佳彈性（25 kPa）的水凝膠基質(zhì)能夠使細(xì)胞保持多能性。進(jìn)一步的研究表明，接枝到水凝膠（儲存模量為25 kPa）上的雙鏈體外連接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的長期生長，可持續(xù)超過10代。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），如纖維連接蛋白、層粘連蛋白和玻璃體連接蛋白，或來自ECM的寡肽，具有特定的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使其成為支持iPSC在無飼養(yǎng)基質(zhì)系統(tǒng)中生長的重要成分。3D生物打印和細(xì)胞/組織打印技術(shù)也為未來的工藝放大和自動化提供了新的可能性。最近的研究表明，當(dāng)iPSC在涂有纖維連接蛋白的無飼養(yǎng)殼聚糖或聚氨酯膜上馴化和擴(kuò)增時，細(xì)胞打印技術(shù)的有效性得到了驗證。在這項研究中，嵌入熱敏聚氨酯（PU）水凝膠基質(zhì)的iPSC顯示出更高的活性。然而，需要進(jìn)一步優(yōu)化基于聚合物的無飼養(yǎng)基質(zhì)，因為PU水凝膠培養(yǎng)的多能性標(biāo)記（如OCT4和NANOG）與對照MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)存在差異。

細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)不僅決定了iPSC的最終行為，還影響了整個生物工藝的成本。盡管在具有監(jiān)測和反饋控制pH值和溶解氧（DO）能力的一次性多層培養(yǎng)器皿中，已經(jīng)證明了在2D靜態(tài)培養(yǎng)中大規(guī)模生長hPSC的可行性，但在2D或3D靜態(tài)基質(zhì)上大規(guī)模生產(chǎn)hPSC仍是一種成本高、勞動密集且空間需求大的方法。已知靜態(tài)培養(yǎng)條件會導(dǎo)致培養(yǎng)基成分、代謝廢物、旁分泌因子和氣體的不利梯度。目前的共識是，動態(tài)懸浮培養(yǎng)是實現(xiàn)臨床應(yīng)用所需的多能干細(xì)胞密度的最佳方法，目前正積極開發(fā)高效且可放大的懸浮多能干細(xì)胞擴(kuò)增的新策略。例如，可以利用成功的基質(zhì)研究來設(shè)計最佳的懸浮培養(yǎng)模式。

iPSC懸浮方式的關(guān)鍵考慮因素 (聚集體、微載體和微膠囊)

無基質(zhì)的iPSC懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)克服了靜態(tài)基質(zhì)在放大生產(chǎn)方面的局限性，同時支持iPSC的生長和多能性維持。由于iPSC的貼壁特性，在懸浮體系中接種和擴(kuò)增時，會自發(fā)形成3D聚集體（或球體）。這些iPSC聚集體與胚狀體（EB）相似，因此可以作為擴(kuò)增后直接進(jìn)行譜系分化的有效途徑。iPSC聚集體的生長和多能性主要受微環(huán)境、聚集體大小分布和細(xì)胞培養(yǎng)罐大小的影響。已有研究對培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得hiPSC在轉(zhuǎn)瓶中于E8™無飼養(yǎng)條件下，以未分化的懸浮細(xì)胞聚集體形式擴(kuò)增超過10代。此后，攪拌懸浮培養(yǎng)已擴(kuò)展至3000 ml的一次性生物反應(yīng)器（1000 ml工作體積），以生產(chǎn)大量的hiPSC聚集體（多達(dá)2x10^9個細(xì)胞），同時保持多能性標(biāo)記物的表達(dá)，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。

然而，動態(tài)懸浮培養(yǎng)中iPSC聚集體的擴(kuò)增存在一些限制。與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)相比，其擴(kuò)增效率較低，且聚集體大小分布不均勻。若不加以控制，細(xì)胞團(tuán)塊（>800 μm）的形成可能導(dǎo)致細(xì)胞活性下降、自發(fā)分化增加、營養(yǎng)和氧氣擴(kuò)散梯度加劇，以及整體擴(kuò)增過程變慢。通過優(yōu)化攪拌槳類型和攪拌速度，可以有效控制iPSC培養(yǎng)中的聚集體尺寸。垂直輪生物反應(yīng)器（VWBR）是一種新型的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，能夠在擴(kuò)增iPSC的同時降低聚集體的大小。該系統(tǒng)通過垂直葉輪攪拌實現(xiàn)容器內(nèi)的高效均質(zhì)化。使用該系統(tǒng)，在保持多能性的同時，成功產(chǎn)生了平均直徑為350 μm的聚集體（最高密度可達(dá)2.3x10^6 cells/ml）。

培養(yǎng)基添加劑對聚集體的形成有顯著影響。例如，在hiPSC聚集體的擴(kuò)增過程中，短期應(yīng)用維甲酸（RA）可以進(jìn)一步維持其多能性。類維生素A通過提高多能依賴性轉(zhuǎn)錄因子（如Nanog和Oct4）的表達(dá)以及激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路來支持iPSC的自我更新。此外，在化學(xué)限定培養(yǎng)基中添加Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制劑Y27632可以促進(jìn)多種懸浮罐類型中從單細(xì)胞接種開始的iPSC聚集體的形成。ROCK抑制劑通過減少解離誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和提高克隆效率來支持干細(xì)胞聚集體的存活。然而，最近的研究表明，長期暴露于ROCK抑制劑會改變iPSC的代謝特性。因此，培養(yǎng)基添加劑、接種策略和生物反應(yīng)器設(shè)置是優(yōu)化生物工藝產(chǎn)量的關(guān)鍵參數(shù)。通過進(jìn)一步優(yōu)化，可以實現(xiàn)足夠用于臨床應(yīng)用的iPSC聚集體的大規(guī)模生產(chǎn)。在這種模式下，需要改進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的運輸機(jī)制和聚集體的大小分布，以在高密度條件下保持細(xì)胞聚集體的多能性和活力。

微載體

在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中加強干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的工作已經(jīng)在微載體的應(yīng)用方面取得了顯著進(jìn)展。微載體的優(yōu)勢在于它們提供了一個表面積以支持多能干細(xì)胞（PSC）的生長和附著，同時保留了動態(tài)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的特點。微載體可用于細(xì)胞種子制備，如果是可生物降解的，還可以在治療過程中用于將細(xì)胞運送到受損組織。各種生物可降解材料通常用于制造針對細(xì)胞系擴(kuò)增的微載體，包括葡聚糖、膠原蛋白、明膠、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）、聚L-乳酸（PLLA）、聚苯乙烯（PS）和羥基磷灰石（HA）。與較大的靜態(tài)基質(zhì)類似，微載體通過其表面電荷的適當(dāng)調(diào)控，以及當(dāng)被細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白（如玻璃體連接蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白）包裹時，為PSC的生長提供了進(jìn)一步增強的支持。攪拌微載體培養(yǎng)系統(tǒng)已被證明可以促進(jìn)貼壁依賴性干細(xì)胞的擴(kuò)增和規(guī)模放大，同時為監(jiān)測和控制干細(xì)胞健康和分化提供了必要的工具。通過增強氧氣供應(yīng)和代謝物的質(zhì)量傳輸以及降低微環(huán)境毒性，PSC的產(chǎn)量得以提高。

然而，在使用微載體擴(kuò)增hiPSC時，存在一些需要考慮的問題。微載體的限制主要取決于其直徑（100-400 μm）、密度（通常為1 g/ml）和化學(xué)成分，這些因素會影響細(xì)胞的附著，從而影響擴(kuò)增能力。由于微球的表面積有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球與細(xì)胞比例的限制。附著在微載體微球上的細(xì)胞需要經(jīng)過酶解和過濾處理，這可能會損害細(xì)胞的活力和多能性，具體取決于所采用的方法。為了解決這一問題，生物可降解微載體正在開發(fā)中。與傳統(tǒng)的聚苯乙烯（PS）微載體相比，無異源可溶性微載體的開發(fā)取得了顯著進(jìn)展，使得轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞回收率大幅提高。

攪拌式生物反應(yīng)器會對微載體微球施加流體動力剪切應(yīng)力，這可能會影響hiPSC的整體健康和多能性。通過優(yōu)化生物反應(yīng)器的工藝參數(shù)（如攪拌速率），可以減輕剪切應(yīng)力對iPSC的不利影響。例如，Gupta及其同事的研究表明，在轉(zhuǎn)瓶中，iPSC在微載體上的長期附著、多能性和擴(kuò)增依賴于維持25 RPM的最佳攪拌速度。這種參數(shù)優(yōu)化方法需要應(yīng)用于更大規(guī)模的iPSC擴(kuò)增（如生物反應(yīng)器）。

微載體微球的制造成本是另一個需要考慮的問題，因為根據(jù)所使用的材料和添加劑，該工藝可能會變得異常昂貴。因此，微載體材料應(yīng)具有成本效益，如果可能的話，應(yīng)可回收，并且在每次生產(chǎn)運行后可消毒。目前，基于微載體的iPSC培養(yǎng)方法正在開發(fā)中，旨在通過控制良好的生物工藝系統(tǒng)實現(xiàn)人類iPSC在細(xì)胞治療和組織工程中的持續(xù)擴(kuò)增和回收。

利用微載體制備人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 的生物工藝研究進(jìn)展，典型工藝包括靜態(tài)培養(yǎng)、放大工藝、下游工藝和制劑，微載體通常在放大過程中引入，在下游工藝過程中去除。

微膠囊化

微膠囊與將細(xì)胞附著在微球表面的微載體不同，微膠囊化涉及將細(xì)胞捕獲在球形膠囊內(nèi)，細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和其它生長因子可以通過球形膠囊擴(kuò)散。球形膠囊由半透性材料或膜組成，在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中可以保護(hù)細(xì)胞免受聚團(tuán)和剪切力的影響。用于生成微膠囊的生物材料包括海藻酸鹽、瓊脂糖、尼龍、膠體、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚賴氨酸-海藻酸鹽水凝膠、醋酸纖維素-乙基纖維素和聚酯膜。通常通過乳化或擠壓方法捕獲細(xì)胞，形成保護(hù)管，使細(xì)胞增殖。總的來說，聚合物微膠囊與凝膠微膠囊相比具有一定的優(yōu)勢，包括生物相容性和GMP相容性。每單位體積的膠囊材料可以容納更多的細(xì)胞，并且由于在膠囊內(nèi)空間存在液體細(xì)胞懸浮液，聚合物膠囊中的顆粒間擴(kuò)散限制不那么嚴(yán)重。

在微膠囊系統(tǒng)中培養(yǎng)的干細(xì)胞既可以維持多能性，也可以被誘導(dǎo)分化，這取決于其膠囊的組成和微環(huán)境中存在的生長因子。微膠囊化技術(shù)在大規(guī)模生產(chǎn)中所面臨的缺點與微載體類似，即制造成本和有限的表面積。此外，一些干細(xì)胞類型，如hMSC，在沒有添加肽或蛋白質(zhì)（如纖連蛋白）的情況下被包裹時 (例如，在海藻酸鹽中) 增殖困難，前者可改善細(xì)胞附著。相比之下，如果細(xì)胞附著增強，在收獲過程中回收被包裹的細(xì)胞可能會帶來更困難的挑戰(zhàn)。

iPSC監(jiān)測技術(shù)、計算機(jī)建模和質(zhì)量設(shè)計

hiPSC敏感的多能性受到細(xì)胞微環(huán)境、代謝和信號通路變化的影響，因此對需調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的細(xì)胞治療和組織工程方法的發(fā)展構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)和微載體系統(tǒng)的最新進(jìn)展為有朝一日實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)用于各種臨床應(yīng)用的hiPSC提供了希望。然而，未來大規(guī)模生物反應(yīng)器 (>5L) 的利用需要開發(fā)新的生物反應(yīng)器監(jiān)測技術(shù)，以便在控制干細(xì)胞分化的同時優(yōu)化iPSC生產(chǎn)過程。

目前有幾種離線分析方法可用于生物反應(yīng)器監(jiān)測，其中許多方法確定重要的過程變量，如細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞活力和培養(yǎng)基中特定成分的濃度。通常使用染料排除法 (即臺盼藍(lán)排除顯微鏡) 和流式細(xì)胞術(shù)來測量細(xì)胞濃度和活力，而一些流式細(xì)胞術(shù)也可以量化PSC群體。最近為提高iPSC表征工作的通量所做的努力表明，將熒光細(xì)胞條形碼 (FCB) 結(jié)合到流式細(xì)胞術(shù)中可以識別多能性和細(xì)胞異質(zhì)性。盡管條形碼方法對連續(xù)平臺不實用，但它們是有用的離線質(zhì)量控制 (QC) 測試方式。質(zhì)譜 (MS) 和高效液相色譜 (HPLC) 已被聯(lián)合用于代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，確定指示或影響多能性的代謝標(biāo)記物和途徑。這些發(fā)現(xiàn)揭示了在代謝物水平上預(yù)測和監(jiān)測iPSC分化的計算機(jī)建模的必要性。有趣的是，糖酵解和蛋氨酸代謝被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化，因此，模擬這些途徑中涉及的關(guān)鍵代謝物的行為可能是一個合適的起點。與此同時，高效液相色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)也得到了改進(jìn)，以促進(jìn)在線和近線測量，例如采樣自動化，但這些技術(shù)仍然受到維護(hù)成本和處理樣品所需時間的限制。Western blots、qPCR或RT-PCR和免疫組織化學(xué) (ELISA) 是常用的檢測方法，通過檢測相對于天然ESC的ESC標(biāo)記基因的表達(dá)水平，來確定hiPSC在特定時間點的代謝功能和分化狀態(tài)。總的來說，在整個制造過程中，有幾種有效的離線分析方法可以確定iPSC的多能性和質(zhì)量。然而，非自動化離線分析測試的樣品收集和準(zhǔn)備，以及儀器和試劑盒的成本和維護(hù)，限制了過程的可放大性，增加了生產(chǎn)成本，犧牲了樣品，并存在培養(yǎng)污染的風(fēng)險。此外，樣品采集和數(shù)據(jù)輸出之間的時間延遲大大限制了它們作為過程控制技術(shù)的實用性。

為了提高工藝可放大性，生物制藥行業(yè)最近開始采用質(zhì)量源于設(shè)計 (QbD) 戰(zhàn)略，其中工藝和產(chǎn)品管理基于科學(xué)知識和風(fēng)險評估。通過這種方式，可以利用傳感器或其它實時檢測變化的分析技術(shù)開發(fā)更靈活的生產(chǎn)工藝，允許通過數(shù)據(jù)驅(qū)動的過程控制進(jìn)行快速響應(yīng)，從而在潛在的運行故障發(fā)生之前減輕故障。QbD框架通過將可測量的細(xì)胞群體的分子和細(xì)胞特征與最終產(chǎn)品質(zhì)量聯(lián)系起來來運作。就iPSC而言，有效的QbD策略需要實時測量影響干細(xì)胞多能性和自我更新的關(guān)鍵參數(shù)。

在線傳感器在生物反應(yīng)器過程實時監(jiān)測方面很有應(yīng)用前景，包括目前最先進(jìn)的DO和pH探針。先前的研究表明，缺氧和生物反應(yīng)器流體動力學(xué)可以共同誘導(dǎo)hiPSC向心肌細(xì)胞分化，因此，DO水平是生產(chǎn)過程中維持iPSC質(zhì)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)。光譜方法，如拉曼和近紅外，也可以作為有用的在線探針來監(jiān)測代謝物 (葡萄糖、乳酸等)，因此，在開發(fā)化學(xué)計量模型和機(jī)器學(xué)習(xí)算法時，可以提供有用的信息，實時預(yù)測和調(diào)節(jié)iPSC多能性。除了標(biāo)準(zhǔn)的工藝特征外，可重復(fù)和穩(wěn)定形成的hiPSC聚集體對工藝可放大性至關(guān)重要。在這方面，某些光學(xué)技術(shù)顯示出作為實時監(jiān)測細(xì)胞健康和分化狀態(tài)的工具的潛力。例如，雙光子激發(fā) (TPE) 熒光顯微鏡光學(xué)測量NAD(P)H和FAD的自身熒光已被證明是監(jiān)測三維組織構(gòu)建中細(xì)胞分化的有效技術(shù)。結(jié)合熒光壽命成像顯微鏡( FLIM)， TPE可以通過NAD(P)H和FAD的光學(xué)氧化還原比和熒光壽命來確定MSC的分化狀態(tài)。通過對NAD+/(NADH + NAD+)的LC-MS/MS測量證實，在分化的MSC培養(yǎng)物中觀察到光學(xué)氧化還原比值的下降，這是為生物反應(yīng)器設(shè)計的TPE-FLIM探針的潛在能力的一個例子。利用TPE-FLIM作為iPSC監(jiān)測工具，必須開發(fā)一種穩(wěn)健而靈活的TPEM探針，可以接近生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞并收集在線數(shù)據(jù)；然而，目前還沒有這樣的產(chǎn)品存在。最近，一種原位顯微成像裝置被開發(fā)出來，用于實時可視化和監(jiān)測連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器中hiPSC聚集。雖然聚集體大小的控制對維持多能性很重要，但分化進(jìn)展的直接指示只能通過安裝熒光顯微鏡模塊來實現(xiàn)。毫無疑問，仍然需要新的創(chuàng)新工具，結(jié)合顯微鏡成像和熒光檢測來評估hiPSC在動態(tài)培養(yǎng)中的多能狀態(tài)。

質(zhì)量控制措施和考慮因素

為了充分發(fā)揮iPSC衍生療法的潛力，iPSC需要在臨床級GMP標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn)。這是一個復(fù)雜的過程，其中iPSC細(xì)胞系、傳代和關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 可比性的表征和論證是必不可少的，并且有充分的記錄。CQA被定義為生物、化學(xué)或物理性質(zhì)，這些性質(zhì)應(yīng)保持在適當(dāng)?shù)南薅葍?nèi)，以維持或控制最終產(chǎn)品的質(zhì)量。隨著自動化、封閉細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和經(jīng)過驗證的測試方案的發(fā)展，iPSC生產(chǎn)線工業(yè)化的目標(biāo)比以往任何時候都更接近。國際干細(xì)胞庫倡議 (ISCBI) 最近為臨床級hiPSC注冊提供了推薦指南，包括：（i）多能性測試; （ii）體外和體內(nèi)分化測試；（iii）核型分析顯示遺傳穩(wěn)定性；（iv）細(xì)胞身份鑒定；（v）通過干細(xì)胞陣列分析基因表達(dá)特性；（vi）微生物試驗。

目前用于iPSC擴(kuò)增的GMP級培養(yǎng)系統(tǒng)需要多次更換培養(yǎng)基和傳代，這導(dǎo)致了顯著的可放大性、可重復(fù)性和成本挑戰(zhàn)。由于這些原因，目前個性化iPSC生產(chǎn)的財務(wù)成本對大多數(shù)患者來說是負(fù)擔(dān)不起的，因此，iPSC庫的構(gòu)建將是有益的。全球iPSC治療聯(lián)盟 (GAiT) 的成立旨在支持針對臨床應(yīng)用的iPSC庫的創(chuàng)建和全球協(xié)調(diào)。Alvarez-Palomo及其同事總結(jié)了創(chuàng)建臨床級iPSC庫的關(guān)鍵考慮因素和標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

iPSC領(lǐng)域的一個主要QC問題是遺傳組穩(wěn)定性。由于可獲得的長期臨床數(shù)據(jù)有限，需要制定嚴(yán)格的遺傳穩(wěn)定性檢測指南。先前涉及iPSC的臨床試驗因在細(xì)胞重編程過程中觀察到單核苷酸變異(snv)和拷貝數(shù)變異(cnv)而暫停。因此，全基因組測序(WGS)，包括snp和比較基因組雜交(CGH)陣列，被推薦作為iPSC產(chǎn)品進(jìn)入臨床前的QC測試。用于生成hiPSC的基因轉(zhuǎn)染平臺也對基因組整合帶來了巨大的安全問題。由多肽生成的非轉(zhuǎn)基因PSC效率較低，mRNA/miRNA轉(zhuǎn)染需要多個步驟，這就產(chǎn)生了批次間的可變性。毋庸置疑，在整個細(xì)胞治療生物工藝中，遺傳標(biāo)記驗證對于開發(fā)安全有效的治療方法至關(guān)重要。

結(jié)束語和未來展望

在過去的十年中，hiPSC生物工藝技術(shù)有了顯著的進(jìn)步，但在臨床應(yīng)用和新產(chǎn)品推出方面的進(jìn)展仍然緩慢。主要挑戰(zhàn)來自基礎(chǔ)生物科學(xué)和當(dāng)前大規(guī)模生產(chǎn)平臺的局限性�，F(xiàn)有的hiPSC工藝開發(fā)和生產(chǎn)方法是勞動密集型的，這在很大程度上限制了工藝的可放大性，并導(dǎo)致不可預(yù)測的批次間可變性。業(yè)界一致認(rèn)為，生產(chǎn)iPSC的最佳方法是懸浮培養(yǎng)，從而提高細(xì)胞的生長能力。當(dāng)選擇懸浮方式進(jìn)行放大時，應(yīng)考慮將多能性iPSC的生長特征與其隨后的分化細(xì)胞類型結(jié)合起來的工藝，因為一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種有益的基質(zhì)來生長特定類型的高質(zhì)量iPSC。與重復(fù)批次工藝相比，完全自動化的灌流操作與培養(yǎng)環(huán)境的反饋控制將允許營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)置換，并獲得顯著更高的細(xì)胞產(chǎn)量。由于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)激敏感性，目前的灌流系統(tǒng)僅成功用于小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。然而，使用現(xiàn)有的ACF培養(yǎng)基和微載體懸浮微球成功擴(kuò)展hiPSC，表明該行業(yè)未來有能力實現(xiàn)可放大的高質(zhì)量PSC密度。此外，存在進(jìn)一步推進(jìn)iPSC工藝發(fā)展領(lǐng)域的額外機(jī)會。

隨著新技術(shù)和新模式的出現(xiàn)，需要工藝友好的表征方法和監(jiān)測工具來控制iPSC在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量。由于基因組和代謝組穩(wěn)定性對hiPSC的重要性，基因組維度的模型可用于確定影響多能性的關(guān)鍵工藝參數(shù)，并指導(dǎo)生產(chǎn)過程中生長表型的優(yōu)化。此外，結(jié)合圖像和熒光顯微鏡的更靈敏的細(xì)胞質(zhì)量檢測工具將進(jìn)一步增強實時監(jiān)測干細(xì)胞分化的PAT。隨著這些分析工具的發(fā)展，進(jìn)一步的培養(yǎng)基優(yōu)化和QbD策略的擴(kuò)大，臨床級iPSC的大規(guī)模生產(chǎn)的目標(biāo)將在未來十年實現(xiàn)。

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• 無外源動物成分，降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險
• 無血清成分，極大降低批次間差異

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產(chǎn)品優(yōu)勢

• 與mTesR體系對標(biāo)，細(xì)胞增殖與形態(tài)無差異；
• 無需滋養(yǎng)層細(xì)胞；
• 營養(yǎng)更豐富，適用于大多數(shù)細(xì)胞系培養(yǎng)，且適用重編程過程細(xì)胞培養(yǎng)；
• 成分明確，批間差異小；
• 無外源動物成分，降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險；

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• 成分確定，批次間差異��；
• 細(xì)胞復(fù)蘇效率高，該凍存液凍存細(xì)胞復(fù)蘇率高于血清凍存方法；
• 即用型產(chǎn)品，且無需程序降溫可直接-80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存；

【參考文獻(xiàn)】

Donnelly Hannah, Salmeron-Sanchez Manuel and Dalby Matthew J. Designing stem cell niches for differentiation and self-renewal. Journal of the Royal Society Interface. 2018​