核酸提取類型
核酸提取是分子生物學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟，根據(jù)不同的核酸類型和應(yīng)用需求，主要包括4種類型。
·總RNA提取：總RNA包括大量的rRNA和少量的mRNA、tRNA、snRNA等�？俁NA的提取通常采用三相酚-氯仿抽提法，通過酚相和氯仿相的分離，有效地將核酸分離出來，適用于從細(xì)胞裂解液中提取RNA。
·miRNA提取：miRNA是短小且高度保守的RNA分子，其提取需要使用特殊的方法，如基于柱層析的技術(shù)或磁珠法。這些方法能夠高效地富集和分離miRNA，以便于后續(xù)的定量分析和功能研究。
·基因組DNA提取：基因組DNA提取通常采用堿裂解法或酚-氯仿法，這些方法能有效地分離和純化高分子量的DNA。保證DNA的完整性對于后續(xù)的基因組研究和診斷至關(guān)重要。
·質(zhì)粒提取：質(zhì)粒提取旨在從細(xì)菌或真核細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA，常用的方法包括堿裂解法和硅膠柱層析。這些方法能夠有效地去除雜質(zhì)，得到高純度的質(zhì)粒DNA用于分子克隆和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)粒最早是20世紀(jì)50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌、酵母菌、放線菌等生物中獨(dú)立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復(fù)制能力，可在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。目前，質(zhì)粒已成為基因工程中一種常用、簡單的載體，除了在科研領(lǐng)域的普遍應(yīng)用，質(zhì)粒也被廣泛用于多類生物醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)環(huán)節(jié)，如重組蛋白藥物、疫苗、基因治療藥物以及CAR-T藥物等。

細(xì)菌質(zhì)粒是一類環(huán)狀雙鏈DNA，大小從1Kb至200 Kb以上不等，一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外自主復(fù)制的遺傳成分。實(shí)驗(yàn)室常用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，菌體在氫氧化鈉和SDS溶液中裂解，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清液中，蛋白質(zhì)與細(xì)菌基因組DNA纏繞呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來，上清中的質(zhì)粒用吸附法純化。

質(zhì)粒的粗提取物通常包含3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA：
·共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)：這是質(zhì)粒DNA最常見的構(gòu)型。質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂，形成一個(gè)完整的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。具有高度的穩(wěn)定性和完整性，是基因工程中常用的質(zhì)粒構(gòu)型。
·超螺旋開環(huán)DNA (ocDNA)：質(zhì)粒的一條鏈斷裂，形成一個(gè)超級(jí)螺旋的開環(huán)結(jié)構(gòu)。ocDNA的穩(wěn)定性稍遜于cccDNA，但仍可用于某些實(shí)驗(yàn)。
·松弛的環(huán)狀分子線形DNA (lDNA)：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂，形成一個(gè)松弛的環(huán)形結(jié)構(gòu)。IDNA的穩(wěn)定性較差，通常在質(zhì)粒提取過程中產(chǎn)生較少。
電泳時(shí)，由快到慢依次是：超螺旋＞線性DNA＞開環(huán)DNA。

2. 質(zhì)粒提取原理
質(zhì)粒提取即去除RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。質(zhì)粒提取主要包括三個(gè)步驟：菌體擴(kuò)繁、菌體裂解釋放質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒DNA的分離與純化。質(zhì)粒提取從具體操作方法分為：堿裂解法、煮沸裂解法、小量一步提取法、試劑盒法、酶解法及其它提取方法等。從提取產(chǎn)量上分為：小提、中提、大提。

1)堿裂解法
原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，成本低，適用于大部分常規(guī)實(shí)驗(yàn)。
缺點(diǎn)：提取純度可能不夠高，需要進(jìn)一步純化。

2)煮沸法
原理：將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會(huì)分離，這是因?yàn)樗麄兊牧姿岫�酯骨架具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL(小量制備)，多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，時(shí)間短。
缺點(diǎn)：條件過于劇烈，易造成質(zhì)粒斷裂，回收率較低。

3)小量一步提取法
原理：由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性，機(jī)械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細(xì)菌染色體DNA復(fù)性較慢，會(huì)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。

4)試劑盒法
原理：通常采用改良的SDS-堿裂解法，結(jié)合硅膠膜在高鹽及低pH值(pH<7.5)時(shí)可結(jié)合DNA，在低鹽及高pH值(pH≥8)條件下洗脫的原理達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。

質(zhì)粒提取方法中，最常用的是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特色，堿裂解法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。其原理是：在強(qiáng)堿環(huán)境(pH=12.0-12.6)下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被SDS破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)、染色體及線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性(質(zhì)粒DNA因?yàn)槠浞肿恿啃《�纏結(jié)嚴(yán)密不易變性)。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH=4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快(可恢復(fù)天然構(gòu)象)，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA(在高鹽條件下，細(xì)胞碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生沉積，離心后可去除。上清中的質(zhì)粒DNA可經(jīng)過乙醇沉積或許硅膠膜特異性吸附等方法，將質(zhì)粒DNA從上清中回收)。

5)酶解法
原理：利用特異性酶裂解細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，釋放質(zhì)粒DNA。
步驟：(1) 細(xì)胞收集：培養(yǎng)含有質(zhì)粒的細(xì)菌，離心收集細(xì)胞。(2) 酶處理：加入溶菌酶等酶類，裂解細(xì)胞壁。(3) 裂解細(xì)胞：加入裂解緩沖液，釋放質(zhì)粒DNA。(4) 純化：使用柱子或其他純化方法分離質(zhì)粒DNA。
優(yōu)點(diǎn)：提取純度高，適用于高需求實(shí)驗(yàn)。
缺點(diǎn)：成本較高，操作時(shí)間較長。

6)其他方法
離子交換法：利用質(zhì)粒DNA與離子交換介質(zhì)的結(jié)合來分離和純化。
超離心法：利用質(zhì)粒DNA與其他分子的密度差異，通過超離心分離。

總結(jié)來說，堿裂解法主要使用三種溶液(根據(jù)1979年J.Doly發(fā)表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)。The principle of alkaline extraction就是選擇性地讓chromosomal DNA發(fā)生變性，而plasmid DNA不會(huì)發(fā)生變性，仍然以雙鏈形式存在。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA具有產(chǎn)量高、操作快速等優(yōu)點(diǎn)，其原理是：在堿性溶液中，雙鏈DNA的氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞而發(fā)生變性，但是由于質(zhì)粒DNA的分子量相對較小，而且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在堿裂解的高pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)完全分離；當(dāng)加入中和緩沖液時(shí)，變性質(zhì)粒DNA又可恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而變性的大分子量細(xì)菌染色體DNA則不能復(fù)性，并與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復(fù)合物；并通過離心，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等都可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA留在上清液中；混雜的RNA可用RNA酶(RNase A)消除，殘留的蛋白質(zhì)可以用酚和氯仿處理去除。

·溶液I (P1)--溶菌液(包含葡萄糖以及EDTA)
主要成分：25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM葡萄糖(Glucose)，P1也可以不含葡萄糖。
主要作用：P1的主要作用是將菌體沉淀懸浮。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA因機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg^2＋、Ca^2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基)；(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫�酶的反�?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

P1的兩個(gè)試劑從用途上看，用水或者LB也可以代替，少了EDTA，提取速度加快一點(diǎn)，也不會(huì)降解那么快。加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部，少了也沒有關(guān)系，只要重懸充分也是一樣的效果。

注意事項(xiàng)：溶液P1需要在使用前加入RNA酶(RNaseA)以降解溶液中的RNA，并保存在4°C以防止蛋白質(zhì)失活。

·溶液II(P2)--NaOH-SDS液
主要成分：250mM NaOH、1%(w/v) SDS(十二烷基磺酸鈉)。
主要作用：P2的主要作用是對細(xì)胞進(jìn)行裂解。
NaOH：核酸在pH>5和pH<9的溶液中是穩(wěn)定的，但當(dāng)pH>12或者pH<3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2 mo1/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO^3-…R⁺-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)發(fā)性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。

溶液II最重要是NaOH，一定要用要新從濃NaOH稀釋制備0.4 N NaOH，保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相發(fā)化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌。

注意事項(xiàng)：添加溶液P2時(shí)需要控制時(shí)間和避免劇烈震動(dòng)，操作要溫柔，以防止基因組DNA斷裂并污染樣品。

·溶液III(P3)--3mol/L NaAc(pH=4.8)溶液
主要成分：3M醋酸鉀(potassium acetate)、5M醋酸。
主要作用：P3的主要作用是中和第二步加入的強(qiáng)堿以及清除蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)。
醋酸：作用是中和強(qiáng)堿。長時(shí)間暴露在強(qiáng)堿性溶液(如氫氧化鈉)中會(huì)對DNA結(jié)構(gòu)造成破壞，因此需要中和處理。
醋酸鉀：作用是清除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在加入P3后，會(huì)觀察到大量沉淀的形成。這些沉淀是由于醋酸鉀中的鉀離子與混合物中的SDS多肽發(fā)生相互作用所致，進(jìn)而生成不溶于水的十二烷基硫酸鉀(PDS)。PDS的沉淀不僅會(huì)沉淀變性的蛋白質(zhì)，還會(huì)與纏繞在變性蛋白質(zhì)上的基因組DNA一同沉淀，導(dǎo)致大部分基因組DNA也被共沉淀。此外，高離子濃度的溶液會(huì)加速這一沉淀過程。在中和溶液后，變性蛋白質(zhì)表面的電荷減少，也會(huì)促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的沉淀。

·Wash buffer(PE)
主要成分：10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol)。
主要作用：去除多余的鹽離子。實(shí)驗(yàn)中大家普遍使用硅膠柱進(jìn)行DNA提取。在DNA吸附到硅膠柱后，需要使用PE洗滌液清洗掉多余的鹽離子。PE中含有高濃度的乙醇，由于乙醇可能影響后續(xù)的酶切或測序反應(yīng)，因此在洗去DNA之前，在離心機(jī)中需要對柱子進(jìn)行“空甩”，以除去乙醇。

·Elution buffer (EB、TE)
主要成分：10mM Tris-HCl (pH=7.5)或者ddH₂O。
主要作用：洗脫硅膠柱上的DNA樣品。
EB緩沖液：EB中不應(yīng)含有過高濃度的鹽離子，因?yàn)楦啕}環(huán)境中，鹽陽離子會(huì)破壞硅膠負(fù)氧根和水之間的氫鍵，導(dǎo)致整體硅膠帶正電荷，進(jìn)而吸引攜帶負(fù)電荷的DNA分子。此外，加熱過的洗脫液(<50℃)能促進(jìn)DNA從硅膠膜上迅速釋放。在離心之前，延長EB緩沖液在膜上停留時(shí)間能更有利于DNA的洗脫。使用ddH₂O進(jìn)行洗脫效率較低，建議在第一次洗脫后，將洗脫液重新加入硅膠柱進(jìn)行第二次洗脫。

質(zhì)粒抽提按得到質(zhì)粒DNA的量可分為小提、中提、大提：

·小提質(zhì)粒
特點(diǎn)：簡便、快速，適用于高通量提取。
濃度：100-200 ng/μL。
用途：適用于測序、PCR、腺病毒包裝以及多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
適用場景：適用于1-5 mL菌液，提取簡便、快速，可用于DNA序列分析、酶促反應(yīng)、PCR等實(shí)驗(yàn)，要求質(zhì)粒濃度不高。

·中提質(zhì)粒
特點(diǎn)：質(zhì)粒DNA量較高。
濃度：0.7-1 μg/μL。
用途：適用于測序和多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
適用場景：適用于30-50 mL菌液，可用于酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。

·大提質(zhì)粒
特點(diǎn)：質(zhì)粒DNA量非常高、雜質(zhì)少、無內(nèi)毒素。
濃度：0.5-2 μg/μL。
用途：適用于慢病毒、腺相關(guān)病毒包裝，以及多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染或其他需要大量質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)。
適用場景：適用于100-500 mL菌液，適用于大規(guī)模提取，提取的質(zhì)粒純度高，無內(nèi)毒素，可用于對質(zhì)粒純度有要求的實(shí)驗(yàn)。

3. 實(shí)驗(yàn)材料
·儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)用具
高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、漩渦振蕩器；
培養(yǎng)用試管、量筒、冰盒、微量離心機(jī)、微量移液器、吸管頭若干。
常見的質(zhì)粒提取試劑盒包括OMEGA、BIOMIGA、Sigma、TaKaRa、Promega、天根、康為世紀(jì)、生工等品牌，它們大多都是在堿裂解法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)而成。

·試劑配制
LB培養(yǎng)基: 稱取胰蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，用雙蒸水溶解至300mL，用10mol/L NaOH溶解調(diào)pH值至7.0-7.2，固體培養(yǎng)基需要加入瓊脂(1.5%)，高壓滅菌。
氨芐青霉素(Amp，100mg/mL): 氨芐青霉素100 mg，加入1 mL雙蒸水溶解。
100×TE緩沖液(含1 mol/L Tris-HCI和100 nmol/L EDTA): 稱取Tris 121.1 g，EDTA-Na2 37.22 g，先用800 mL雙蒸水加熱攪拌溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.0(大約需要鹽酸20 mL)，再加雙蒸水定容至1000 mL。
溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH=8.0)，10mM EDTA (pH=8.0)。1M Tris-HCl(pH=8.0) 12.5mL，0.5M EDTA(pH=8.0) 10mL，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500mL。高壓滅菌15min，貯存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1mL，加ddH2O 至10mL。使用前臨時(shí)配置。
溶液Ⅲ：醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300mL，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)
乙醇(無水乙醇、70%乙醇)
5×TBE：Tris堿54g， 硼酸 27.5g，EDTA-Na₂·2H₂O 4.65g，加 ddH₂O 至1000mL。高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
溴化乙錠(EB)：10 mg/mL
RNase A：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/mL，TE 配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。
6×loading buffer(上樣緩沖液)：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青 FF，40%(w/v)蔗糖水溶液。
1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100mL 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加 EB 母液(10mg/mL)至終濃度0.5μg/mL (注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套)，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中(電泳緩沖液 0.5×TBE)，即可上樣。

4. 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)步驟(以堿裂解法為例)
質(zhì)粒提取主要包括四個(gè)步驟：菌體擴(kuò)繁、菌體裂解釋放質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA的分離與純化和質(zhì)粒DNA的電泳檢測，今天以堿裂解法為例進(jìn)行介紹。

實(shí)驗(yàn)步驟：
(1)搖菌培養(yǎng)
1) 將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
2) 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長出菌落。
3) 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號(hào)標(biāo)記。
4) 挑取單克隆菌落放置液體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基放置1個(gè)菌落。
5) 37℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜(約 12-16h)。

(2)收獲細(xì)菌并裂解
主要有堿裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢x器設(shè)備擇取不同的實(shí)驗(yàn)方案。
·堿裂解法：
1) 柱平衡。向吸附柱中加入500 μL的Buffer B溶液。12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2) 取3 mL過夜培養(yǎng)的菌液，12000 rpm離心1 min，棄盡上清。每次1 mL分3次完成。
3) 加入250 μL Buffer P1懸浮菌體沉淀。
4) 加250 μL Buffer P2，溫和并充分上下翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌體充分裂解直至形成清亮粘稠的溶液。
5) 加入350 μL Buffer P3，溫和并充分上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm 離心10 min。
6) 吸取上一個(gè)步驟中的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱，12000 rpm離心1 min，棄廢液。
7) 吸附柱放回離心管加入600 μL Buffer W，12000 rpm離心1 min，棄廢液。
8) 重復(fù)上述步驟。
9) 將吸附柱放回離心管，12000 rpm離心2 min，將吸附柱中殘存漂洗液去除。
10) 將吸附柱移入1.5 mL離心管，在吸附柱中央加入50 μL去離子水/Elution buffer。室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，收集質(zhì)粒溶液。
11) 收集到的溶液即為質(zhì)粒溶液。測量溶液濃度和純度，剩下的質(zhì)粒溶液置于-20℃冰箱保存。

·煮沸法：
1) 將1.5ml培養(yǎng)液倒入EP管中，4℃下12000 rpm離心30 s。
2) 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3) 將菌體沉淀懸浮于120 mL STET溶液中，渦旋混勻。
4) 加入10 mL新配制的溶菌酶溶液(10 mg/mL)，渦旋振蕩3秒鐘。
5) 將EP管放入沸水浴中，50s后立即取出。
6) 用微量離心機(jī)4℃下12000 rpm離心10 min。
7) 用無菌牙簽從EP管中去除細(xì)菌碎片。
8) 取20 mL進(jìn)行電泳檢查。

·酚氯仿裂解法：
1) 從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化菌陽性克隆，接種到標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)液中(含有卡那霉素30 μg/mL)搖菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉淀加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿(1：1體積)混合液，劇烈振動(dòng)10 s，混勻；12 000g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層；上清經(jīng)國產(chǎn)0.22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內(nèi)加入2倍體積無水乙醇，振蕩10 s，12000 rpm離心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。
2) 按PstI內(nèi)切酶說明書進(jìn)行酶切反應(yīng)(37°C，1h)。酶切產(chǎn)物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。
3) PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為714 bp。
4) 常規(guī)制備感受態(tài)菌E.coli DH5α，提取質(zhì)粒DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂于含有卡那霉素(30 μg/mL) LB培養(yǎng)平板中，37°C培養(yǎng)15 h后觀察篩選克隆情況。

(3)質(zhì)粒的純化
1) 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5 mL離心管中，加入1/10體積的3 mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2) 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6 h或過夜。
3) 4℃，高速離心機(jī)14000 rpm，離心20 min。
4) 棄去上清，70%乙醇洗2次。
5) 空氣干燥，可置超凈工作臺(tái)干燥。
6) 加200 μL無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。
7) 紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。

測量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。

質(zhì)粒DNA可以用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度。一般來說，OD230為碳水化合物、多肽、苯酚等，OD260為核酸，OD280為蛋白質(zhì)。OD260/OD280的比值常用于判DNA或RNA溶液的純度，其通常在1.8~2.0左右，純DNA的比值為1.8，純RNA為2.0。OD260/OD230比值大于2.0，如果比值小于2.0，說明被糖類、鹽類或有機(jī)溶劑污染。

(4)質(zhì)粒DNA 的電泳檢測
觀察瓊脂凝膠中DNA 的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。

DNA 吸收254nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm 和366nm 有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm 處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA 1-2 μL，加適當(dāng)loading buffer 混勻上樣，采用1-5 V/cm 的電壓，使DNA 分子從負(fù)極向正極移動(dòng)至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測并拍照。

5. 注意事項(xiàng)
(1) 高壓滅菌消毒的過程必須專人看管，以免發(fā)生安全事故。
(2) 抗生素不能高壓滅菌，需通過過濾除菌。培養(yǎng)基滅菌后，待冷卻至不燙手時(shí)才加入抗生素，若是已滅菌并冷藏備用的液體培養(yǎng)基，則在使用前根據(jù)需要加入抗生素。
(3) 為避免細(xì)菌污染環(huán)境，多余的菌液需經(jīng)煮沸殺菌后方可丟棄。
(4) 細(xì)菌的細(xì)胞壁成分會(huì)抑制限制性內(nèi)切酶的活性，離心收集細(xì)菌時(shí)若未除盡培養(yǎng)基，其中殘留的細(xì)菌細(xì)胞壁可能會(huì)對酶切產(chǎn)生影響。
(5) 加入溶液I、溶液II、溶液III后，混勻時(shí)一定要溫和，以防染色體DNA分子斷裂。
(6) 酚/氯仿抽提時(shí)，離心分層后吸取上層水溶液應(yīng)非常小心，避免吸入下層的酚/氯仿和中間層的沉淀。
(7) 離心時(shí)應(yīng)將離心管的管蓋突出小柄統(tǒng)一朝向外側(cè)，以保證沉淀于離心管的外側(cè)，便于后續(xù)操作。
(8) 使用之前，需要把試劑盒中的一小管RNA酶加入到Buffer P1，4℃保存。
(9) Buffer EB在65-70℃水浴預(yù)熱，可以增加提取效率。

6. 常見問題及解答
(1) 質(zhì)粒提取試劑盒選擇
質(zhì)粒提取方法主要根據(jù)質(zhì)粒DNA分子量的大小，所用細(xì)菌的種屬，細(xì)菌裂解釋放DNA后的純化方法和實(shí)驗(yàn)要求來選擇。
·質(zhì)粒DNA的分子大于15kb時(shí)，在質(zhì)粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細(xì)菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，這樣可以緩解高滲透壓的細(xì)菌在釋放質(zhì)粒DNA時(shí)的壓力，保護(hù)質(zhì)粒DNA。
·小分子的質(zhì)粒DNA可以選用相對劇烈的方法來分離DNA�？梢杂弥蠓蟹�，堿裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢劑裂解細(xì)菌。這些方法會(huì)使DNA變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起，在恢復(fù)正常條件后，DNA便會(huì)復(fù)性。

·對于那些經(jīng)變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用煮沸法。而這些碳水化合物在密度梯度中會(huì)緊靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的區(qū)帶，因此很難避免，而這些碳水化合物可抑制多種限制酶的活性。這類菌株制備質(zhì)粒時(shí)，不宜采用煮沸法。
·菌株含有限制性核酸內(nèi)切酶A的不宜使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒苁箖?nèi)切酶A完全失活，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中再用限制性內(nèi)切酶消化時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。此時(shí)必須用酚：氯仿進(jìn)行抽提。

(2) 質(zhì)粒提取的得率低或無質(zhì)粒
菌體老化：重新涂布篩選，挑選新的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
質(zhì)�？截悢�(shù)低：篩選新的高拷貝的菌體。
堿裂解不充分：收集的菌體含量較高時(shí)，可以酌情提高溶液1/2/3的含量。
乙醇?xì)埩�，漂洗液沒有去除干凈。
洗脫處理不當(dāng)：洗脫液加入較多或者洗脫時(shí)間過短。

(3) 質(zhì)粒的純化不足
混有RNA，RNase A處理不徹底。
混有基因組DNA，避免加入溶液2，3時(shí)劇烈震蕩。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量；細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解。

(4) 質(zhì)粒DNA產(chǎn)量低
可能原因：細(xì)菌培養(yǎng)不充分；裂解不完全；質(zhì)粒DNA丟失在提取過程中。
解決方案：確保細(xì)菌培養(yǎng)充分，通常需要過夜培養(yǎng)，達(dá)到適宜的OD600值；檢查裂解緩沖液的成分和pH值，確保裂解充分；檢查各步驟操作是否規(guī)范，避免質(zhì)粒DNA的流失；使用更高效的提取試劑盒。

(5) 質(zhì)粒DNA純度低
可能原因：基因組DNA或RNA污染；蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)殘留。
解決方案：在裂解過程中加入RNA酶，去除RNA污染；嚴(yán)格控制堿裂解時(shí)間，避免基因組DNA斷裂混入質(zhì)粒DNA；充分離心，去除細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)；使用酚-氯仿提取或硅膠柱純化質(zhì)粒DNA。

(6) 質(zhì)粒DNA降解
可能原因：操作過程中存在DNase污染；存儲(chǔ)條件不當(dāng)。
解決方案：使用無DNase的試劑和耗材；操作時(shí)戴手套，避免手部接觸樣品；將質(zhì)粒DNA存儲(chǔ)在-20℃或-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融。

(7) 質(zhì)粒DNA無法轉(zhuǎn)化或低轉(zhuǎn)化效率
可能原因：質(zhì)粒DNA質(zhì)量不高；受體細(xì)胞狀態(tài)不佳。
解決方案：確保質(zhì)粒DNA的純度和濃度，進(jìn)行測序驗(yàn)證；使用新鮮的感受態(tài)細(xì)胞，確保細(xì)胞處于最佳狀態(tài)；優(yōu)化電轉(zhuǎn)化或熱轉(zhuǎn)化條件。

(8) 質(zhì)粒DNA濃度測定不準(zhǔn)確
可能原因：樣品中含有蛋白質(zhì)、鹽類或其他雜質(zhì)；光譜儀校準(zhǔn)不準(zhǔn)確。
解決方案：進(jìn)行純化步驟，去除雜質(zhì)；使用分光光度計(jì)前進(jìn)行校準(zhǔn)，并使用適當(dāng)?shù)目瞻讓φ铡?/span>

(9) 質(zhì)粒DNA無法完全溶解
可能原因：質(zhì)粒DNA沉淀不完全溶解；溶液pH值不合適。
解決方案：使用溫和的溶液如TE緩沖液溶解質(zhì)粒DNA；輕輕混勻，避免劇烈搖動(dòng)；確保溶液的pH值適合質(zhì)粒DNA溶解。

(10) 出現(xiàn)剪切或片段化的質(zhì)粒DNA
可能原因：操作過程中物理剪切；過度震蕩或攪拌。
解決方案：輕柔操作，避免劇烈的震蕩或攪拌；使用合適的提取方法，減少質(zhì)粒DNA的機(jī)械損傷。

(11) 質(zhì)粒純度的選擇
同樣對于一般的載體構(gòu)建等常規(guī)實(shí)驗(yàn)和送去測序檢測的話，用手工和試劑盒制備的DNA都能達(dá)到要求。如果是質(zhì)粒需要用來做細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的話，則需要無熱源，無內(nèi)毒素(LPS)。

(12) 菌液較多
可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會(huì)影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致提取量和純度偏低。質(zhì)粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會(huì)細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體中的質(zhì)粒DNA釋放出來，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復(fù)中性環(huán)境，利于質(zhì)粒DNA復(fù)性，溶液II中SDS的Na⁺會(huì)被K⁺置換，SDS變?yōu)镻DS并結(jié)合大分子的基因組DNA，蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質(zhì)粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗�，以免使基因組DNA斷裂污染質(zhì)粒。所用時(shí)間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)操作會(huì)得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當(dāng)按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。

(13) 菌液培養(yǎng)時(shí)間
使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時(shí)間一般在16 h左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致菌體生長不充分，培養(yǎng)時(shí)間過長菌體會(huì)出現(xiàn)死亡，導(dǎo)致活菌比例降低，進(jìn)而基因組DNA污染概率增大，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)優(yōu)選的控制在12-16 h內(nèi)。

(14) 宿主菌株
宿主菌株的種類將會(huì)影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株如HB101、JM101、JM110、TG1以及它們的衍生菌株，通常因?yàn)閮?nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會(huì)顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10、DH5α進(jìn)行質(zhì)粒純化。

(15) 質(zhì)�？截悢�(shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時(shí)的體積。當(dāng)所提取的質(zhì)粒大于10 kb時(shí)，由于菌體承載力有限，大質(zhì)粒復(fù)制效率往往會(huì)低于普通質(zhì)粒，因此推薦增大菌液量以獲得更好的提取產(chǎn)量。

(16) 菌體中無質(zhì)粒
有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。有時(shí)菌種保存一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況，導(dǎo)致無法提出質(zhì)粒，若有保存的質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化后再挑取單克隆搖菌提質(zhì)粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

(17) 堿裂解不充分
使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。

(18) 溶液使用不當(dāng)
溶液II在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。

(19) 吸附柱過載
不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

(20) 質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))
洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。

(21) 乙醇?xì)埩?/strong>
漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30min，或放到超凈臺(tái)上風(fēng)吹15 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(22) 鹽離子污染
當(dāng)漂洗操作不當(dāng)或漂洗不充分時(shí)將導(dǎo)致鹽離子污染，該指標(biāo)可通過OD260/230比值鑒定，通常大于2.0是可接受的。在使用試劑盒時(shí)應(yīng)確保Wash Buffer的漂洗次數(shù)和漂洗液加入量。

(23) 洗脫液加入位置不正確
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率，若第一次沒有將洗脫液準(zhǔn)確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。

(24) 洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或ddH₂O。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH=7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。為追求高濃度質(zhì)粒而減小洗脫液體積將會(huì)導(dǎo)致洗脫不充分進(jìn)而降低產(chǎn)量，因此要確保洗脫液的用量，此外Elution Buffer預(yù)熱至60℃和重復(fù)洗脫將更有利于洗脫效率提升。

(25) 洗脫體積太小
洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

(26) 洗脫時(shí)間過短
洗脫時(shí)間對回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)在說明書的建議時(shí)間基礎(chǔ)上適當(dāng)延長靜置或者洗脫兩次可達(dá)到較好的效果。

(27) 質(zhì)粒保存方法
提取后的質(zhì)粒除了本身質(zhì)量外，也應(yīng)注意提供適宜的保存環(huán)境，以防止質(zhì)粒降解影響下游應(yīng)用，一般質(zhì)�？杀４嬗赥E溶液中，在4℃短期保存，在-80℃或-20℃中長期保存。除了直接保存質(zhì)粒，還應(yīng)將含質(zhì)粒的宿主菌保存于甘油中，-80℃或液氮中可長期保存。

(28) 質(zhì)粒內(nèi)毒要求
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和蛋白復(fù)合物，當(dāng)細(xì)菌裂解時(shí)會(huì)大量釋放出來。

內(nèi)毒性也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性(如大腸桿菌E.coli)胞膜上一種成分。細(xì)菌外膜的外部脂質(zhì)成分完全由內(nèi)毒素分子組成。一個(gè)E.coli包含約2百萬個(gè)LPS分子，每個(gè)LPS分子又由疏水性的脂質(zhì)A、復(fù)雜的多糖鏈以及帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)組成。因此每個(gè)內(nèi)毒素既包含疏水區(qū)域也包含了親水和帶電區(qū)域，從而賦予其與其它分子相互作用的獨(dú)特性質(zhì)。細(xì)菌在其活躍生長時(shí)表面的內(nèi)毒素成分較少，而一旦其死亡則會(huì)釋放大量內(nèi)毒素。在質(zhì)粒提取的裂解過程中，內(nèi)毒素會(huì)從細(xì)菌的外膜釋放到裂解液中。LPS污染通常用內(nèi)毒素單位(Endotoxin Units, EU)表示，通常情況下，1ng LPS對應(yīng)于1-10個(gè)EU。

由于內(nèi)毒素兩親性和負(fù)電荷性，性質(zhì)和DNA類似，因此在質(zhì)粒純化過程中會(huì)伴隨質(zhì)粒一同被純化出來。

內(nèi)毒素單位為EU，質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量的高低常用EU/µg表示。按照EU/µg大小，質(zhì)粒被分為3個(gè)級(jí)別：測序級(jí)別(>50EU/µg)、轉(zhuǎn)染級(jí)別(<50EU/µg)、無內(nèi)毒素級(jí)別(<0.1EU/µg)。

(29) 影響質(zhì)粒提取的因素有哪些？
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)菌細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

(30) 為什么從革蘭氏陽性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶菌酶？
革蘭氏陽性菌有一層細(xì)胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。

(31) 如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同級(jí)別的產(chǎn)品？
從純度上：各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化，普通純度的質(zhì)�？梢詽M足要求；而對于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿足要求。
從提取的量上：1-20μg，應(yīng)選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應(yīng)選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應(yīng)選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上：分為普通細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、革蘭氏陽性菌質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒，根據(jù)情況進(jìn)行選擇。