本文來源于：新藥新發(fā)現(xiàn)

蛋白水解靶向嵌合體 (PROTAC) 是一種新興的靶向降解蛋白質的治療策略，它通過將目標蛋白（POI）帶至 E3 連接酶附近，利用泛素蛋白酶體系統(tǒng) (UPS) 來促進蛋白質的降解。相比傳統(tǒng)的抑制蛋白活性，PROTAC 能夠選擇性地從細胞中清除特定蛋白，提供了事件驅動的降解機制，避免了單純的占用率依賴。藥理學上，PROTAC 有助于更徹底地阻斷蛋白功能，延長作用時間，并可能模擬基因敲除的效果。由于三元復合物的形成依賴于 POI 和 E3 的特異性相互作用，PROTAC 能夠選擇性地作用于特定異構體和組織。研究表明，PROTAC 已在臨床中顯示出良好的耐受性和療效，目前正在后期臨床試驗中。阿斯利康概述了 PROTAC 各組成部分的優(yōu)化以及藥物化學家在這一充滿挑戰(zhàn)的領域尋求實現(xiàn)口服生物利用度所面臨的困難。并基于性質，總結 PROTAC 優(yōu)化的方法。

01 Clinical PROTACs

截至2024年7月，共有13種結構公開的蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）進入臨床試驗，主要用于腫瘤治療，其中一種用于炎癥治療。兩種PROTAC（ARV-110和KT-413）因戰(zhàn)略原因停產。在這些化合物中，12種與E3連接酶cereblon（CRBN）結合，只有DT-2216使用von Hippel-Lindau (VHL) E3連接酶，且需靜脈注射。CRBN結合PROTAC的分子量在711-958 Da之間，親脂性（pH 7.4下的logD）在1.4-4.8范圍內，色譜極性表面積（ePSA）范圍為107-146 Ų。圖2A顯示，口服PROTAC（藍色區(qū)域）大多超出Lipinski的“5法則”（Ro5）和Veber的指南（綠色區(qū)域），但氫鍵供體（HBD）除外。在親脂性方面，部分PROTAC超過小分子的logP（≤5）和logD（1-3）限制。ePSA的范圍較窄，顯示其在口服PROTAC設計中更具指導價值。盡管超出傳統(tǒng)物理化學限制，口服仍為首選給藥途徑，除DT-2216和KT-413外，這兩者專為血液系統(tǒng)癌癥開發(fā)。

02 Structure of PROTACs

每種臨床蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）都經過廣泛優(yōu)化，以在藥理和物理化學特性之間實現(xiàn)最佳平衡。PROTAC 的設計包括三個模塊化組分——目標蛋白（POI）、E3連接酶配體和連接基，設計技巧在于平衡各個部件的特性，使得最終的 PROTAC 化合物特性整體可接受。

目標蛋白（POI）： PROTAC 通常使用對目標蛋白具高效結合力的抑制劑或拮抗劑，多為中性分子并且氫鍵供體（HBD）數量較少，這樣可以避免暴露的 HBD，以利于提高細胞膜透過性。大多數臨床PROTAC 的 POI 結合基序溶解性較好，并能連接到 E3 連接酶配體，某些 PROTAC（如 ARV-393）含有少數幾個正式供體，但分子內氫鍵可能屏蔽了這些供體以減少親水性。

E3連接酶配體： 在臨床 PROTAC 中，cereblon（CRBN）是最常用的 E3連接酶，因其低分子量、高極性和高效性成為理想選擇。CRBN 配體通常來源于免疫調節(jié)藥物（IMiD）如沙利度胺（Thalidomide）和來那度胺（Lenalidomide），其主要化學結構包括戊二酰亞胺或二氫尿嘧啶環(huán)，具有一個氫鍵供體且對外排轉運蛋白無敏感性。為了應對 IMiD 類配體的安全問題（如致畸性和血液毒性），一些新的 CRBN 配體被應用于 PROTAC，如包含差向異構體混合物的 KT-474 和 CFT-1946 等，其中二氫尿嘧啶基團在 CFT-1946 中展現(xiàn)出改良的化學和代謝穩(wěn)定性。

連接子： PROTAC 的連接基通常為單個叔胺堿基（例如哌啶、哌嗪或氮雜環(huán)丁烷），這些堿性基團通常經過適度調節(jié)，以確保 pKa 在合理范圍內。對于口服 PROTAC，堿性通常低于預測 pKa 9.1。連接基中多含有環(huán)狀結構以增加剛性和構象穩(wěn)定性，大部分臨床口服 PROTAC 中至少包含兩個環(huán)，而在靈活性方面則使用少量亞甲基或乙氧基作為間隔基。例如，CFT-1946 的連接基較為剛性，因其酰胺將哌啶與螺環(huán)連接起來，而 KT-474 的連接基較靈活，使用了炔丙基醚間隔基。高剛性的連接基有助于提升靶標降解效力和代謝穩(wěn)定性，而靈活的連接基則在靜脈注射的 DT-2216 中表現(xiàn)較好，DT-2216 的可旋轉鍵數量（29個）遠超可接受的范圍，但其高度靈活性適合非口服給藥。

03 Optimization and Challenges

口服 PROTAC 的生物利用度設計面臨顯著挑戰(zhàn)。由于 PROTAC 的三部分結構，使分子量低于約 700 Da 的設計難以實現(xiàn)，這通常違反了 Lipinski 的分子量規(guī)則，同時保持其他 Ro5 標準（如 HBA、HBD、logP）和物理化學描述符（如 PSA、可旋轉鍵）在可接受范圍內也具有難度。盡管如此，PROTAC 已在臨床前研究和人體實驗中顯示出一定的生物利用度，能夠達到有效的藥物暴露水平。

隨著 PROTAC 的不斷探索，藥物化學家積累了關鍵的物理化學參數數據，提供了新的設計見解。Arvinas 和 AstraZeneca 的研究表明，口服吸收的關鍵在于減少溶劑暴露的氫鍵供體（eHBD）數量，兩者均獨立得出 eHBD≤2 的設計標準，即便分子量、親脂性、極性和 HBA 等物理化學性質超過了傳統(tǒng)的 Ro5 限值。相關研究表明，對于大環(huán) bRo5 藥物，酰胺類 HBD 的數量應不超過 2，但正式 HBD 數量可更高，總計不超過 7 個。CRBN 結合基序的小分子特點也符合 eHBD≤2 的標準，這種設計使口服 PROTAC 達到有效生物利用度成為可能，盡管面臨挑戰(zhàn)。合理分配“分子特性預算”，尤其是控制 HBD 數量，是 PROTAC 設計成功的關鍵因素。

The three-body problem

PROTAC 的靶向蛋白質降解功能依賴于三元復合物的有效形成，這種復合物能夠促進表面賴氨酸的泛素化。然而，由于可能存在多種構象且并非所有構象都能導致降解，三元復合物的建模十分具有挑戰(zhàn)性。PROTAC 的大型分子結構及 POI-linker-E3 組分的相互作用，使得其設計需要更高的“化學公平性”，以確保活性。鑒于形成有效三元復合物的標準仍不明確，生成活性 PROTAC 需要克服設計與合成的重重障礙。

為應對這一挑戰(zhàn)，藥物化學家已采用“庫”的生成方法，通過廣泛的化學空間探索，以經驗性手段找到可行的組合。開發(fā)“PROTAC 工具箱”也提供了一種靈活的篩選方法，包含多種 E3 連接酶、配體和接頭的組合，以找到理想的異雙功能分子。活性 PROTAC 隨后需進一步優(yōu)化以提升降解效率及改善物理化學性質。當前的化學研究表明，PROTAC 中的線性接頭逐漸轉變?yōu)榄h(huán)狀、構象受限版本，以平衡溶解度和細胞滲透性，這也成為設計的共同趨勢。

為提高篩選效率并減少浪費，研究人員還開發(fā)了“直接生物學”或“納米 SAR”方法，以便在細胞中直接篩選納摩爾級的非純化庫，為 PROTAC 的快速、高效和經濟可持續(xù)的發(fā)現(xiàn)提供了新思路。

Shape shifting chimeras

PROTAC 的三部分組成和分子大小使其在構象理解上比傳統(tǒng)小分子更具挑戰(zhàn)性。藥物化學中常用的策略是通過預先組織分子以采取生物活性構象，從而減少結合時的熵懲罰。然而，PROTAC 的配體由于具備較大的構象自由度，加之三元復合物周圍的構象可塑性和不確定性，使得模仿哪種“生物活性”構象成為一大難題。

結合 NMR 技術和分子動力學（MD）模擬的研究表明，PROTAC 的構象行為和滲透性在極性（如重水或 DMSO-d6）與非極性溶劑（如 CDCl3）中存在差異。這些差異揭示了構象集合、端到端回折及潛在分子內氫鍵 (IMHB) 的信息，被稱為“變色龍”分子內折疊。與未折疊的分子相比，折疊狀態(tài)的 CRBN 和 VHL 結合 PROTAC 顯示出更高的被動細胞滲透性。而對具有更剛性連接基的 PROTAC（如 ARV-110、ARV-766、ARV-471 和 KT-474）的研究則表明，在不同溶劑中，延伸的構象異構體更為穩(wěn)定。

The world must be measured by eye

PROTAC 領域的一個關鍵挑戰(zhàn)在于，傳統(tǒng)小分子優(yōu)化程序的體外檢測方法是否能為 PROTAC 提供有意義的數據。這些較大的、親脂性較強的分子易附著在實驗器皿、蛋白質或膜上，導致滲透性和蛋白結合檢測中的回收率不佳。同時，傳統(tǒng)的搖瓶法難以檢測出 logD 值大于 4 的化合物，而溶解度也往往低于檢測限，使得缺乏數據的候選物分類變得更具挑戰(zhàn)性。盡管如此，代謝穩(wěn)定性測試（如肝細胞和微粒體孵育）對篩除不穩(wěn)定的 PROTAC 提供了有價值的指標。

為改進 PROTAC 的優(yōu)化，研究者已借鑒 bRo5 領域的經驗，通過色譜法（ChromlogD 和 ePSA）拓展了測量的親脂性和極性范圍，并結合計算機模擬來生成相關的 3D 描述符，從而提升設計成功率。此外，在 FaSSIF 和 FeSSIF 等生物相關溶液中的溶解度測量和“預飽和”法為游離水平的估計提供了更準確的方式。盡管 PROTAC 的親脂性較傳統(tǒng)小分子藥物（logD 1-3）更高（13 種臨床 PROTAC 中 9 種的 logD≥3），但最終的藥代動力學特征仍需通過體內評估在高等動物模型、毒性研究乃至人體中進一步驗證。

Pitfalls to avoid

將 CRBN 結合實體（尤其是 IMiD）整合到 PROTAC 中帶來了潛在的安全風險。這些風險源于 PROTAC 可能充當分子膠水降解劑 (MGD)，引發(fā)多種蛋白質（新底物）降解，導致毒理學效應。例如，新底物 GSPT1 是一個翻譯終止因子，其降解可能會降低蛋白質合成率并引發(fā)細胞毒性，而誤導性地掩蓋目標 POI 的實際降解情況。此外，不僅 CRBN 配體具有 MGD 活性，其他 E3 連接酶如 VHL 的配體也表現(xiàn)出類似特性。一些 PROTAC 甚至顯示出源于 POI 配體的 MG 活性，如一款 JQ1 衍生的 PROTAC 就通過 DCAF16 而非預期的 DCAF15 降解 BRD4，凸顯了嚴格控制實驗的重要性，以確保 PROTAC 的機制安全有效。

在發(fā)現(xiàn)階段到體內評估過程中，理解 PROTAC 的代謝命運同樣至關重要。即便代謝穩(wěn)定的 PROTAC，其代謝產物往往更具極性和較低親脂性，可能降低三元復合物的有效性，進而削弱體內療效。此外，盡管精心設計避免 MGD 活性，CRBN 結合 PROTAC 的代謝物仍可能具備 MGD 活性，從而帶來潛在安全風險。因此，當前臨床試驗對這些風險的評估將幫助確定 CRBN 基 PROTAC 是否適用于非腫瘤適應癥。

04 Conclusions

PROTAC 模式已實現(xiàn)了其最初的靶向蛋白質降解的承諾，多個高質量的降解劑已進入臨床評估階段，尤其是在腫瘤治療領域，并以 CRBN 為首選 E3 連接酶。初步數據表明，PROTAC 在人體中具備生物學效能和口服生物利用度，進一步驗證了其應用潛力。在結構已公開的 PROTAC 中，常見的結構特征如堿基和富環(huán)連接子，以及 eHBD≤2 等物理化學參數，為設計提供了寶貴的參考。

PROTAC 以及其他大分子候選藥物的出現(xiàn)，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng) Ro5 規(guī)則，表明某些規(guī)則可以被重新審視甚至突破。與類似的創(chuàng)新性例子一同，PROTAC 正在重新定義“口服生物可利用化學空間”，表明在探索新領域的邊界時，應保持開放態(tài)度，同時避免簡單地對化學設計設定新的限制。