正畸牙齒移動（OTM）依賴于力誘導(dǎo)的骨重塑，其中在張力側(cè)有新骨沉積，在壓力側(cè)有骨質(zhì)吸收。牙槽骨骨髓間充質(zhì)細胞（alveolar bone marrow mesenchymal cells，ABMMCs）是一類位于牙槽骨中的骨髓間充質(zhì)干細胞，具有增殖、遷移和成骨分化特性。它們已被證明對機械力敏感，能夠感知機械信號并將其轉(zhuǎn)化為復(fù)雜的生物反應(yīng)。因此，闡明機械力下ABMMCs中與骨重塑相關(guān)的細胞活動及其潛在機制對于正畸治療至關(guān)重要。

由機械力引發(fā)的骨重塑是一個復(fù)雜的生物過程，需要大量的能量來合成與細胞增殖、分化和功能相關(guān)的大分子（如DNA、RNA和蛋白質(zhì)）。葡萄糖已被公認(rèn)為骨骼發(fā)育和生長的主要能量來源，糖酵解已被證明是滿足骨重塑所需能量的主要途徑。在先前的研究中，觀察到在機械作用下糖酵解受刺激，葡萄糖消耗和乳酸生成增加。此外，糖酵解還為其他代謝途徑提供中間物和底物，如1，6-果糖二磷酸、丙酮酸和乳酸。最近有報道稱，這些中間物可以作為信號分子來調(diào)節(jié)各種細胞活動和功能。

乳酸作為糖酵解過程中產(chǎn)生的上述中間物之一，已被發(fā)現(xiàn)在生理和病理條件下發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。乳酸的產(chǎn)生主要發(fā)生在細胞質(zhì)中，它來源于乳酸脫氫酶 A（LDHA）對丙酮酸的轉(zhuǎn)化。乳酸通過其轉(zhuǎn)運蛋白（單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白）和受體（G蛋白偶聯(lián)受體81）參與傷口愈合、內(nèi)皮細胞遷移、腫瘤發(fā)展和免疫細胞極化的調(diào)節(jié)。據(jù)研究，乳酸在血液和健康組織中的生理濃度約為1.5-3 mM，但在炎癥部位可升至10 mM，在癌組織中可升至近20-30 mM。然而，目前尚不清楚乳酸在OTM過程中是否因機械力而改變，或者乳酸在這種濃度下對骨重塑的影響是什么。

基于此，山東省口腔組織再生重點實驗室和山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室研究團隊在一項研究中，觀察到在機械力下，ABMMCs的乳酸生成增加，伴隨成骨分化、增殖和遷移增強，此外，發(fā)現(xiàn)機械拉伸衍生的乳酸能夠通過組蛋白乳酸化促進ABMMCs的成骨分化、增殖和遷移，同時減少細胞凋亡。該研究結(jié)果揭示了乳酸作為OTM過程中牙槽骨重塑的介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵作用，并在力相關(guān)代謝物的功能領(lǐng)域進行了一系列研究。具體內(nèi)容發(fā)表在 CELLS期刊題為“Mechanical Force Modulates Alveolar Bone Marrow Mesenchymal Cells Characteristics for Bone Remodeling during Orthodontic Tooth Movement through Lactate Production”。
 

首先，研究人員在ALP染色和茜素紅S染色中分別觀察到成骨誘導(dǎo)后鈣沉積和礦化結(jié)節(jié)增強，證明了ABMMCs的成骨分化潛力。油紅O染色顯示ABMMCs具有成脂分化的潛力。然后，評估了機械刺激對ABMMCs成骨分化的影響，在循環(huán)機械拉伸下（10% 伸長率，0.5Hz，正弦波形，6、12、24h）評估基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，結(jié)果表明成骨相關(guān)基因（ALP和RUNX2）的表達在6 h時開始增加，并在12 h時達到峰值。同時，ALP和RUNX2在蛋白水平上的表達也因機械力提高，ABMMCs細胞的ALP酶活性在循環(huán)拉伸24 h后顯著增加。此外，還證實了循環(huán)機械拉伸促進ABMMCs成骨分化的能力。上述研究結(jié)果證實了ABMMCs的多向分化潛力和克隆形成能力，表明ABMMCs是可自我再生的多能細胞。

接下來，為了評估體內(nèi)OTM過程中LDHA和乳酸生成的表達，實驗建立了大鼠OTM模型，并觀察了左上頜第一磨牙的近中移動。IHC結(jié)果顯示，正畸力應(yīng)用7天后，牙槽骨張力側(cè)和壓力側(cè)LDHA的表達增加，LDHA陽性細胞百分比增加，平均光密度（AOD）增加（圖1 A-C）。與壓力側(cè)相比，張力側(cè)LDHA的表達略高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1 A-C）。一致地，在 OTM 7 天后，移動磨牙周圍的牙槽骨中的乳酸濃度也上調(diào)（圖1 D）。就體外研究結(jié)果而言，實驗觀察到在循環(huán)張力作用12 h后ABMMCs 中 LDHA 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平表達顯著升高（圖1 E-G）。此外，循環(huán)機械拉伸24h后，細胞內(nèi)乳酸增加約2.5倍，細胞外乳酸達到2-3 mM（圖1 H、I）。上述研究結(jié)果表明，機械力在體內(nèi)和體外均能促進LDHA的表達和乳酸的產(chǎn)生。

圖1 機械力增加乳酸脫氫酶A（LDHA）的表達和乳酸的產(chǎn)生。

（A）通過免疫組織化學(xué)（IHC）確定 OTM 期間 LDHA 在張力側(cè)（a）和壓力側(cè)（b）的表達。LDHA的表達由LDHA陽性細胞百分比（B）和平均光密度（AOD）（C）測定。（D）經(jīng)正畸力7天后牙槽骨中的乳酸含量。（E）拉伸0、6、12和24 h后LDHA在mRNA水平上的表達。（F、G）拉伸0、6、12和24 h后LDHA在蛋白質(zhì)水平上的表達。 （H）拉伸0、6、12和24 h后的細胞內(nèi)乳酸濃度。（I）拉伸0、6、12和24h后的細胞外乳酸濃度。

進一步地，為了研究機械力誘導(dǎo)的乳酸對ABMMCs成骨分化的影響，實驗應(yīng)用了GNE-140（一種特異性LDHA抑制劑）來抑制循環(huán)機械拉伸過程中乳酸的產(chǎn)生。在循環(huán)機械拉伸期間暴露于 GNE-140 24h導(dǎo)致 ABMMCs 中細胞內(nèi)和細胞外乳酸顯著降低，但在靜態(tài)條件下未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的抑制作用。GNE-140在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平上顯著減弱了生理機械力導(dǎo)致的成骨標(biāo)志物ALP和RUNX2的表達升高，同時，減弱了由循環(huán)機械拉伸增強的細胞內(nèi) ALP 活性和 ABMMCs 中的礦化結(jié)節(jié)。這些結(jié)果表明，通過抑制乳酸生成可以抑制ABMMCs在機械力下增強的成骨分化。上述結(jié)果揭示了，機械力誘導(dǎo)的乳酸可以促進ABMMCs的成骨分化。

此外，實驗還評估了機械力誘導(dǎo)的乳酸對其他骨重塑相關(guān)細胞活動的影響，包括ABMMCs的增殖、凋亡和遷移。結(jié)果表明，循環(huán)拉伸處理24 h后，促進了ABMMCs的增殖，而GNE-140明顯減弱了這種效應(yīng)（圖2 A）。同時，生理性周期拉伸可以誘導(dǎo)細胞周期進程，如S期和G2/M期細胞比例增加，而GNE-140明顯抑制了這一趨勢（圖2 B-D）。細胞凋亡方面，在機械力作用下未觀察到ABMMCs的顯著改變，而GNE-140顯著增加ABMMCs的凋亡（圖2 E、F）。此外，生理性周期性拉伸顯著誘導(dǎo)了ABMMCs的遷移（圖2 G、H），而GNE-140可以消除ABMMCs中機械力的這種促遷移效應(yīng)。這些結(jié)果表明，機械力誘導(dǎo)的生理性乳酸促進了ABMMCs的增殖和遷移，但抑制了細胞凋亡。上述結(jié)果揭示了，乳酸通過調(diào)節(jié)ABMMCs的細胞特性在骨重塑過程中發(fā)揮重要功能。

圖2 GNE-140在循環(huán)機械拉伸下抑制ABMMCs的增殖和遷移，但促進細胞凋亡。

（A）有或沒有循環(huán)機械拉伸下通過 CCK-8 測試確定 ABMMCs 在 GNE-140/DMSO 處理組中的增殖。（B-D）有或沒有循環(huán)機械拉伸下GNE-140/DMSO 處理組中 ABMMCs 的細胞周期分布（B）、細胞周期分布百分比（C）以及S和G2/M期百分比（D）。（E、F）有或沒有循環(huán)機械拉伸下在 GNE-140/DMSO 處理組ABMMCs 中Annexin V-FITC/PI 雙染色。（G、H）有或沒有循環(huán)機械拉伸下GNE-140/DMSO 處理組中 ABMMCs 劃痕測定的代表性圖像（G）和傷口愈合區(qū)域（H）。

最近的研究發(fā)現(xiàn)了一種新的組蛋白修飾，稱為組蛋白乳酸化，它參與了巨噬細胞的修復(fù)性轉(zhuǎn)化。由于乳酸是組蛋白乳酸化的底物，因此，實驗最后研究了乳酸的上述作用是否由組蛋白乳酸化介導(dǎo)。在OTM過程中，乳酸化組蛋白水平在牙槽骨的張力側(cè)和壓力側(cè)均上調(diào)，而在張力側(cè)的表達水平明顯高于壓縮側(cè)（圖3 A-C）。同時，免疫熒光（IF）和WB結(jié)果也證實了ABMMCs在循環(huán)拉伸24 h后乳酸化組蛋白水平升高（圖3 D-G）。這些結(jié)果表明，在機械力作用下，乳酸化組蛋白和乳酸生成之間存在相似的改變模式。

接著分析了組蛋白乳酸化與乳酸生成之間的關(guān)系。與對照組（DMSO）相比，GNE-140顯著降低乳酸化組蛋白水平（圖3 H-K）。此外，染色質(zhì)免疫沉淀測序結(jié)果顯示，GNE-140 處理組中代表性基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游 2 kb區(qū)域中乳酸化組蛋白的富集受到抑制（圖3 L）。RT-qPCR結(jié)果也進一步驗證了GNE-140在ABMMCs中降低了這些基因的表達（圖3 M）。這些結(jié)果表明，機械力衍生乳酸對骨重塑的調(diào)節(jié)作用是由組蛋白乳酸化介導(dǎo)的。因此，組蛋白乳酸化被證實為乳酸的關(guān)鍵介質(zhì)，以發(fā)揮其在OTM期間牙槽骨重塑中的調(diào)節(jié)功能。

圖3 組蛋白乳酸化介導(dǎo)乳酸對ABMMCs的調(diào)節(jié)作用。

（A、B）OTM 期間，IHC 在張力側(cè)（a）和壓力側(cè)（b）測定的組蛋白乳酸化水平。組蛋白乳酸化水平由 Pan-Kla 陽性細胞（B）和 AOD（C）的百分比確定。（D、E）有或沒有周期拉伸下乳酸化組蛋白的水平由 IF 確定。（F、G）有或沒有周期拉伸下乳酸化組蛋白的水平由 WB 確定。（H、I）GNE-140/DMSO 處理組中由 IF 測定的乳酸化組蛋白水平。（J、K）在 GNE-140/DMSO 處理組中WB 測定的乳酸化組蛋白水平。（L）相關(guān)基因位點組蛋白乳酸化染色質(zhì)免疫沉淀測序信號的基因組快照。（M）DMSO/GEN-140 組中代表基因在 mRNA 水平上的表達。

圖4 拉伸刺激的乳酸通過組蛋白乳酸化促進ABMMCs中ALP、Runx2、Ki67、CCNA1、BCL2和SDF1的表達。在拉伸刺激下，ABMMCs中乳酸的產(chǎn)生可以升高。拉伸誘導(dǎo)的乳酸通過相關(guān)基因的組蛋白乳酸化進一步促進ABMMCs的增殖、遷移和成骨分化。ABMMCs：牙槽骨骨髓間充質(zhì)細胞；NADH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；LDH：乳酸脫氫酶。

總之，該研究證實了在 OTM 期間，在機械力作用下存在生理性升高的乳酸。此外，還揭示了乳酸在調(diào)節(jié)骨重塑相關(guān)細胞活性和ABMMCs特征中的作用。研究發(fā)現(xiàn)了乳酸是 OTM 期間牙槽骨重塑的潛在調(diào)節(jié)因子，為改善正畸過程中牙槽骨重塑提供了新的治療靶點。

參考文獻：Zhai M, Cui S, Li L, Cheng C, Zhang Z, Liu J, Wei F. Mechanical Force Modulates Alveolar Bone Marrow Mesenchymal Cells Characteristics for Bone Remodeling during Orthodontic Tooth Movement through Lactate Production. Cells. 2022 Nov 22;11(23):3724. doi: 10.3390/cells11233724. PMID: 36496983; PMCID: PMC9738738.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36496983/

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