動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致心絞痛、心肌梗塞或缺血性中風(fēng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展初期到晚期階段起著核心作用。內(nèi)皮極性是維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)功能所必需的，包括剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗凝血作用和屏障功能。內(nèi)皮極性的喪失導(dǎo)致通透性和白細(xì)胞募集的增加，并導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

細(xì)胞極性是指某些細(xì)胞質(zhì)成分在空間順序上的分布不均勻，導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞骨架等細(xì)胞成分組織不對(duì)稱。細(xì)胞極性主要有兩種類型，第一種類型是頂-底極性（ABP），另一種類型是平面極性（PCP）。平面細(xì)胞極性指極性細(xì)胞沿著一個(gè)共同的平面統(tǒng)一排列（上皮細(xì)胞平面細(xì)胞極性與頂端-基底的極性垂直）。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)皮極性受流動(dòng)剪切應(yīng)力（FSS）的調(diào)控，而層流剪切應(yīng)力（LSS）促進(jìn)內(nèi)皮PCP的形成。然而，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）對(duì)內(nèi)皮PCP的影響尚不清楚。

TET1（10-11 轉(zhuǎn)位蛋白1）是催化 DNA 去甲基化的關(guān)鍵蛋白，主要在早期胚胎細(xì)胞中高表達(dá)。TET1 的截短異構(gòu)體——TET1s，其蛋白結(jié)構(gòu)缺失 CXXC 結(jié)合域，廣泛在成體組織表達(dá)，并有研究指出 TET1s 通過(guò)非 DNA 去甲基化途徑調(diào)控基因表達(dá)。

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院、生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王貴學(xué)教授、邱菊輝研究員課題組在之前的研究表明，TET1s參與保護(hù)血管內(nèi)皮屏障，其表達(dá)受不同剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)。在進(jìn)一步的深入研究中，該課題組又在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，探討了 TET1s 在 FSS 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞 PCP 的調(diào)節(jié)中的作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在 APL Bioengineering 期刊題為“Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization”。

首先，在大鼠主動(dòng)脈弓內(nèi)彎施加OSS（5 dyn/cm²），在胸主動(dòng)脈施加LSS（12 dyn/cm²）刺激ECs，通過(guò)比較主動(dòng)脈弓和胸主動(dòng)脈的內(nèi)皮形態(tài)學(xué)差異，探討OSS對(duì)ECs PCP的影響。與胸主動(dòng)脈ECs相比，主動(dòng)脈弓內(nèi)彎的ECs伸長(zhǎng)率降低、核橢圓度降低、細(xì)胞密度增加。

細(xì)胞骨架（微管/MT 和微絲/F-肌動(dòng)蛋白）的分布和排列是 ECs 中 PCP 的重要特征。與胸主動(dòng)脈的ECs相比，主動(dòng)脈弓內(nèi)彎的ECs長(zhǎng)軸上游的微管組織中心（MTOC）顯著增加，兩側(cè)顯著降低，下游無(wú)差異。然后研究了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排。結(jié)果表明，胸主動(dòng)脈ECs中含有大量平行于細(xì)胞長(zhǎng)軸排列的F-肌動(dòng)蛋白，且大部分橫貫細(xì)胞。相比之下，主動(dòng)脈弓 ECs 沿細(xì)胞邊緣呈圓形的 F-肌動(dòng)蛋白線，細(xì)胞中僅存在少量長(zhǎng)度較短的 F-肌動(dòng)蛋白（圖1 a）。血流誘導(dǎo)的極化ECs高爾基體主要位于核長(zhǎng)軸上游，是PCP的標(biāo)志。通過(guò)免疫熒光觀察高爾基體在主動(dòng)脈弓和胸主動(dòng)脈內(nèi)彎的ECs中的細(xì)胞內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)高爾基體主要分布在核長(zhǎng)軸的上游和兩側(cè)，少數(shù)高爾基體分布在胸主動(dòng)脈ECs的下游，主動(dòng)脈弓內(nèi)彎ECs上游的高爾基體明顯減少，而兩側(cè)的高爾基體明顯增加。

這些結(jié)果表明，與LSS相比，OSS在體內(nèi)抑制了血管內(nèi)ECs中的PCP。

圖1 C57BL/6J小鼠（WT小鼠）胸主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓內(nèi)皮細(xì)胞f -肌動(dòng)蛋白（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的免疫熒光染色和表面。

為了進(jìn)一步研究OSS對(duì)內(nèi)皮PCP的影響，HUVECs通過(guò)體外平行板流室裝置暴露于LSS或OSS 48小時(shí)，觀察不同剪切應(yīng)力刺激的ECs的形態(tài)變化。結(jié)果表明，與LSS相比，在OSS條件下細(xì)胞伸長(zhǎng)受到顯著抑制。

然后研究了不同剪切應(yīng)力對(duì)HUVEC細(xì)胞骨架（包括微管和微絲）的影響。與LSS刺激的HUVECs相比，OSS顯著增加了MTOC在細(xì)胞核長(zhǎng)軸上游的分布，但降低了核兩側(cè)的分布。體外培養(yǎng)的微絲的形態(tài)與體內(nèi)相似。LSS刺激的HUVECs含有大量的F-肌動(dòng)蛋白，平行于細(xì)胞的長(zhǎng)軸排列，且大部分F-肌動(dòng)蛋白也橫穿細(xì)胞。相比之下，OSS 刺激的 HUVECs 沿細(xì)胞邊緣呈環(huán)形 F-肌動(dòng)蛋白帶，細(xì)胞中也存在少量長(zhǎng)度較短的 F-肌動(dòng)蛋白.在體外，與LSS相比，高爾基體更有可能分布在暴露于OSS的HUVECs中細(xì)胞核長(zhǎng)軸的兩側(cè)。這種現(xiàn)象在體外比在體內(nèi)更明顯。

這些結(jié)果表明，OSS在體內(nèi)和體外均抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞PCP。

接下來(lái)，為了研究不同剪切應(yīng)力對(duì)ECs中TET1s表達(dá)的影響，將HUVECs暴露于LSS或OSS中48 h。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與LSS相比，OSS組的TET1s表達(dá)水平顯著降低。這些結(jié)果表明，OSS抑制了ECs中TET1s的表達(dá)。

為了檢驗(yàn) TET1 的降低是否是 OSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 PCP 損傷的關(guān)鍵因素，研究人員構(gòu)建了一種 TET1s 過(guò)表達(dá)的腺病毒來(lái)轉(zhuǎn)染暴露于 OSS 的HUVECs（圖2 a、b）。與對(duì)照（NC）組相比，過(guò)表達(dá)TET1s（OE）組的細(xì)胞伸長(zhǎng)率顯著增加（圖2 c、d）。然而，核橢圓度沒(méi)有顯著變化，它可能是由與流動(dòng)相關(guān)的其他通路調(diào)節(jié)的，而不是由TET1s調(diào)節(jié)的。

此外，還測(cè)試了TET1s過(guò)表達(dá)對(duì)暴露于OSS的HUVECs中內(nèi)皮細(xì)胞骨架和高爾基體定位的影響。在TET1s過(guò)表達(dá)的HUVECs中，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的數(shù)量和長(zhǎng)度顯著增加，且大部分F-肌動(dòng)蛋白平行于血流方向，而MTOC和高爾基體相對(duì)于細(xì)胞核的定位沒(méi)有差異。

這些數(shù)據(jù)表明，TET1s過(guò)表達(dá)可以挽救OSS抑制的內(nèi)皮PCP。
 

圖2 過(guò)表達(dá)的 TET1 挽救了 OSS 抑制的內(nèi)皮 PCP。

因?yàn)閮?nèi)皮微管和高爾基體的定位和分布沒(méi)有明顯受到影響，因此，重點(diǎn)研究了TET1s對(duì)微絲的影響。結(jié)果顯示，敲除TET1s的表達(dá)降低了LSS誘導(dǎo)的HUVECs中F-肌動(dòng)蛋白聚合的數(shù)量和長(zhǎng)度，并且平行于流動(dòng)方向的F-肌動(dòng)蛋白的排列也顯著降低。通過(guò)比較小鼠TET1−/− 和TET1cs/cs 之間胸主動(dòng)脈 ECs 的差異，發(fā)現(xiàn)TET1s的缺乏降低了F-肌動(dòng)蛋白的聚合率和長(zhǎng)度。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1（sFRP-1）調(diào)節(jié) EC 細(xì)胞骨架重組，其表達(dá)受表觀遺傳途徑調(diào)控。為了進(jìn)一步探討TET1s參與內(nèi)皮PCP調(diào)控的機(jī)制，對(duì)TET1−/−小鼠和TET1CS/CS小鼠血漿中sFRP-1水平進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TET1s缺失可顯著降低血漿sFRP-1水平，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TET1s的缺失可顯著降低sFRP-1的mRNA水平。相反，在體外，暴露于 OSS 的 HUVECs 中過(guò)表達(dá)的 TET1s 增加了sFRP-1 的表達(dá)和分泌。

ECs高度表達(dá)Fzd家族成員卷曲蛋白4（Fzd4），并已證實(shí)sFRP-1/Fzd4調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組。通過(guò)免疫沉淀技術(shù)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OSS顯著降低了sFRP-1/Fzd4的相互作用。然而，TET1s 的過(guò)表達(dá)部分恢復(fù)了 OSS 抑制的 sFRP-1 與 Fzd4 的相互作用。

為了確認(rèn) sFRP-1/Fzd4 信號(hào)通路參與 TET1s 誘導(dǎo)的 F-肌動(dòng)蛋白聚合，將 sFRP-1 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到過(guò)表達(dá)的 TET1s HUVECs中，從而敲低 sFRP-1 的表達(dá)（圖3 a-c），結(jié)果表明，敲低 sFRP-1 表達(dá)損害了 TET1s 誘導(dǎo)的 F-肌動(dòng)蛋白聚合（圖3 d、e）。

這些數(shù)據(jù)表明，TET1s的缺乏損害了LSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞PCP，SFRP-1/Fzd4介導(dǎo)TET1S誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白聚合。

圖3 敲低 sFRP-1 阻斷 TET1s 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 F-肌動(dòng)蛋白聚合。

上述已經(jīng)證明 TET1s 促進(jìn) ECs 中 sFRP-1 的表達(dá)，但其機(jī)制尚不清楚。最后，實(shí)驗(yàn)研究了TET1s是否通過(guò)DNA去甲基化促進(jìn)ECs中sFRP-1的表達(dá)，通過(guò)dot-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了暴露于OSS的過(guò)表達(dá)TET1s HUVECs的整體DNA甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的TET1s不會(huì)導(dǎo)致整體DNA甲基化和羥甲基化水平的變化。采用DNA免疫沉淀-qPCR分析CpG島的羥甲基化水平，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的TET1s增加了sFRP-1基因啟動(dòng)子的第二個(gè)CpG島的羥甲基化水平。此外，TET1s顯著降低了sFRP-1基因啟動(dòng)子的第二個(gè)CpG島的甲基化水平。這些結(jié)果表明，TET1s的過(guò)表達(dá)介導(dǎo)了sFRP-1基因啟動(dòng)子的去甲基化。

因此，這些結(jié)果表明，TET1s是FSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮PCP調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素。該調(diào)節(jié)是通過(guò)改變 sFRP-1 啟動(dòng)子的去甲基化，從而影響 sFRP-1/Fzd4 的相互作用，并最終介導(dǎo) F-肌動(dòng)蛋白。

綜上所述，該研究表明，TET1s 參與調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 PCP 變化。TET1s 促進(jìn) sFRP-1 啟動(dòng)子區(qū)域的 sFRP-1 去甲基化水平。作為EC細(xì)胞骨架重組的調(diào)控因子，sFRP-1的高表達(dá)通過(guò)sFRP-1/Fzd4信號(hào)通路導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白聚合，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮PCP。這些發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)展了我們對(duì)TET1s在OSS誘導(dǎo)的PCP損傷中的作用的理解，而且可用于OSS驅(qū)動(dòng)的血管疾病的潛在治療。

參考文獻(xiàn)：Qu K, Wang C, Huang L, Qin X, Zhang K, Qiu J, Wang G. Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization. APL Bioeng. 2023 Jul 31;7(3):036104. doi: 10.1063/5.0141289. PMID: 37533755; PMCID: PMC10393427.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37533755/

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