鑒于化療和腫瘤蛋白靶向治療在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的局限性，免疫治療方法已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。然而，免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）的長期獲益僅發(fā)生在少數(shù)患者中，這表明迫切需要確定免疫抑制的其他機(jī)制，包括在腫瘤微環(huán)境（TME）中的機(jī)制，這可能會影響免疫治療的療效。巨噬細(xì)胞是TME中最豐富的免疫細(xì)胞之一，其活性通過多種機(jī)制與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。在生理和惡性發(fā)育過程中，巨噬細(xì)胞存在于“M1 型”促炎、免疫刺激表型和“M2 型”抗炎、血管生成、免疫抑制表型之間。

NSCLC TME中巨噬細(xì)胞的類型具有臨床意義，NSCLC基質(zhì)中M2型巨噬細(xì)胞的存在與預(yù)后不良有關(guān)。例如，抑制巨噬細(xì)胞衍生的精氨酸酶-1（Arginase-1，一種抑制T細(xì)胞增殖的精氨酸消耗酶）正在臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)中。因此，理解和潛在地靶向產(chǎn)生免疫抑制巨噬細(xì)胞表型的潛在機(jī)制，特別是那些起源于單個NSCLC的巨噬細(xì)胞表型，將是很重要的。不同的NSCLC可能對TME中的巨噬細(xì)胞表型產(chǎn)生不同的影響。因此，我們需要一種可獲得且可重復(fù)的臨床前模型，該模型可以被操縱來解剖單個NSCLC細(xì)胞系如何產(chǎn)生特定的巨噬細(xì)胞表型。該模型可以作為研究調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的治療策略平臺。

來自美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心各處的研究人員曾旨在開發(fā)一種可重復(fù)且和生理相關(guān)的體外共培養(yǎng)模型，以研究參與巨噬細(xì)胞極化的腫瘤細(xì)胞和TME因子，并探討可能的治療策略。雖然存在類似的共培養(yǎng)研究，但沒有一項研究詢問了大量具有廣譜分子亞型的患者來源的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系對誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的影響。因此，該團(tuán)隊建立了一個多細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括72株不同患者來源的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系、人類腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMDMs），通過qRT-PCR研究誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型，并通過定量免疫組織化學(xué)在體內(nèi)使用非小細(xì)胞肺癌異種移植物進(jìn)行驗(yàn)證，并與癌癥基因組圖譜（TCGA）“匹配”患者腫瘤進(jìn)行臨床驗(yàn)證。研究成果發(fā)表在 Journal of Thoracic Oncology 期刊題為“Tumor Cells Modulate Macrophage Phenotype in a Novel In Vitro Co-Culture Model of the NSCLC Tumor Microenvironment”。

實(shí)驗(yàn)建立了小鼠 BMDMs、患者來源的 NSCLC 細(xì)胞和患者 CAFs 的多細(xì)胞共培養(yǎng)模型，以確定腫瘤細(xì)胞對巨噬細(xì)胞極化的影響。由于巨噬細(xì)胞來源于小鼠骨髓，實(shí)驗(yàn)利用一組小鼠特異性引物對巨噬細(xì)胞相關(guān)基因（Arginase-1、Il-1β、Socs3、iNos、Il-6、Ym-1）的表達(dá)進(jìn)行qPCR分析，以評估巨噬細(xì)胞表型，此外研究了72 株不同的 NSCLC 細(xì)胞系和患者來源的 NSCLC CAF 細(xì)胞系�？傮w而言，與單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相比，大量患者來源的NSCLC 細(xì)胞系最常在共培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)Arginase-1、Il-1β 和 Socs3 表達(dá)的增加。

為了表征給定基因的高表達(dá)與低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)將高表達(dá)定義為與單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)相比變化≥75倍，將<75倍的變化定義為低表達(dá)。通過這種方法，Arginase-1（Arghi），通常與免疫抑制性 M2 樣表型相關(guān)，是最常見的誘導(dǎo)表型，其次是Il-1β和Socs3。因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了Arghi和Arglow 細(xì)胞群的臨床病理和分子特征，以研究可能與共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中Arginase-1高表達(dá)相關(guān)的因素。

定量研究Arghi和Arglow細(xì)胞系巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的差異，僅發(fā)現(xiàn)一個巨噬細(xì)胞基因 Il-6 在 Arghi 組的表達(dá)高于Arglow組。此外對一組15種NSCLC共培養(yǎng)物進(jìn)行了批量RNAseq以比較qRT-PCR和RNAseq結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在這個小組中巨噬細(xì)胞中 Arginase-1 的高表達(dá)與在相同的NSCLC 共培養(yǎng)的RNAseq樣本中觀察到的巨噬細(xì)胞表達(dá)模式顯著相關(guān)。為了進(jìn)一步研究小鼠巨噬細(xì)胞平臺的發(fā)現(xiàn)是否可以在人巨噬細(xì)胞重現(xiàn)，使用了單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞與兩種Arghi和Arglow細(xì)胞系共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Arghi細(xì)胞系類似地將共培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞極化為M2樣狀態(tài)。因此，通過這種共培養(yǎng)模型，說明72 株不同的患者來源的 NSCLC 細(xì)胞系可重復(fù)地（對于每種細(xì)胞系模型）在共培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)差異表達(dá)模式，最常見的是免疫抑制性 Arghi表型。

接下來，為了研究Arghi細(xì)胞系誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型是否在體內(nèi)也能觀察到，實(shí)驗(yàn)建立了Arghi細(xì)胞系（5株）和Arglow細(xì)胞系（6株）的裸鼠皮下異種移植，以測定宿主小鼠巨噬細(xì)胞的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Arglow系構(gòu)建的NSCLC 異種移植物相比，Arghi系構(gòu)建的NSCLC異種移植物的總巨噬細(xì)胞中位數(shù)密度和Arg1+ 巨噬細(xì)胞密度均顯著高于Arglow系。因此，實(shí)驗(yàn)觀察到來自Arghi NSCLC細(xì)胞系的異種移植腫瘤在腫瘤基質(zhì)中具有顯著更高的宿主小鼠Arg1+巨噬細(xì)胞密度，為體外研究結(jié)果提供了獨(dú)立的體內(nèi)證實(shí)。

為了研究臨床樣本中共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的外部有效性，實(shí)驗(yàn)研究了患者來源的 NSCLC 細(xì)胞系的 RNA 表達(dá)和突變數(shù)據(jù)，以“匹配”TCGA 數(shù)據(jù)庫中具有相似mRNA表達(dá)和DNA突變譜的個體患者腫瘤標(biāo)本。然后，我們利用來自TCGA和CIBERSORT的批量RNAseq表達(dá)數(shù)據(jù)量化這些臨床標(biāo)本TME 中的相對 M1 型和 M2 型巨噬細(xì)胞。這種方法能夠?qū)�NSCLC共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型與臨床樣本中M2：M1巨噬細(xì)胞的比例相關(guān)聯(lián)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自任何一種NSCLC細(xì)胞系的共培養(yǎng)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)模式與分子匹配的TCGA患者腫瘤中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞表型（來自CIBERSORT RNA表達(dá)分析）顯著相關(guān)。與Arghi NSCLC細(xì)胞系匹配的TCGA樣本的M2：M1比值顯著高于與Arglow 細(xì)胞系匹配的TCGA樣本。

這些發(fā)現(xiàn)表明，共培養(yǎng)系統(tǒng)中的患者來源的 NSCLC 細(xì)胞系誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型，這些表型不僅在體內(nèi)異種移植物中發(fā)現(xiàn)的相同 NSCLC 細(xì)胞系，而且與 TCGA 來源的患者腫瘤標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞表型相關(guān)，具有相似的 mRNA 和突變譜。這突出表明，實(shí)驗(yàn)中的模型有可能提供一個臨床相關(guān)的平臺，從中研究調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的腫瘤細(xì)胞和TME因子。

最后，研究人員探討了NSCLC模型中的臨床病理學(xué)或人口統(tǒng)計學(xué)因素與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型之間是否存在任何相關(guān)性。迄今為止，尚未對這些因素在多種NSCLC腫瘤或患者來源的細(xì)胞系中對巨噬細(xì)胞表型的影響進(jìn)行大規(guī)模研究。令人驚訝的是，沒有一個標(biāo)準(zhǔn)的臨床或分子變量與Arghi或Arglow NSCLC系顯著相關(guān)。這些因素包括年齡、性別、種族、吸煙狀況、臨床分期、腫瘤基因型、總突變負(fù)荷、組織學(xué)亞型和上皮/間充質(zhì)表型。

在觀察特定的NSCLC腫瘤基因型時，發(fā)現(xiàn)在Arghi或Arglow隊列中，最常見的基因突變是TP53、KRAS、TP53/KRAS、STK11和EGFR，與先前的研究相似。然后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步定量研究了肺癌細(xì)胞系中巨噬細(xì)胞Arginase-1 的表達(dá)與關(guān)鍵突變腫瘤基因（TP53、KRAS、STK11、KEAP1）的單獨(dú)存在或相互組合，沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著差異。

鑒于在體外共培養(yǎng)模型中，NSCLC腫瘤基因型與巨噬細(xì)胞Arginase-1表達(dá)之間沒有顯著相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)還研究了這些發(fā)現(xiàn)是否在TCGA沉積的臨床NSCLC樣本中也觀察到，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)M2：M1比值在性別、組織學(xué)亞型、年齡、總突變負(fù)荷或腫瘤基因型方面沒有顯著差異。因此，令人驚訝的是，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞系的臨床病理學(xué)、人口統(tǒng)計學(xué)和分子學(xué)特征與巨噬細(xì)胞Arginase-1表達(dá)的高誘導(dǎo)或低誘導(dǎo)無關(guān)，這些因素也與TCGA數(shù)據(jù)集中的巨噬細(xì)胞表型無關(guān)。
 

圖1 非小細(xì)胞肺癌共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型研究綜述。

（A）肺癌共培養(yǎng)系統(tǒng)測定。（B） 臨床病理學(xué)和人口統(tǒng)計學(xué)分析。（C）癌基因型分析和臨床相關(guān)性。

總之，該研究中的共培養(yǎng)系統(tǒng)是一個可獲得的、集中的、可重復(fù)的NSCLC TME中巨噬細(xì)胞活性模型。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與 CAFs 和小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，大量患者來源的 NSCLC 細(xì)胞系最常誘導(dǎo)免疫抑制性 Arginase-1 的高表達(dá)，這與主要的臨床、人口統(tǒng)計學(xué)和分子腫瘤基因型相關(guān)因素?zé)o關(guān)。這些表型在體內(nèi)異種移植物中得到概括，并在TCGA沉積的腫瘤數(shù)據(jù)集中進(jìn)一步得到臨床驗(yàn)證。該共培養(yǎng)模型是早期研究NSCLC TME巨噬細(xì)胞生物學(xué)的有效工具，也是一個易于使用的系統(tǒng)，可用于研究遺傳表達(dá)譜、臨床病理相關(guān)性、計劃體內(nèi)研究的早期驗(yàn)證，以及篩選可能靶向巨噬細(xì)胞活性的新型化合物。因此，該共培養(yǎng)模型是一個強(qiáng)大的、生理一致的平臺，從中可以研究腫瘤細(xì)胞和TME的特征以及可能影響巨噬細(xì)胞表型的新療法。

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參考文獻(xiàn)：Park JV, Chandra R, Cai L, Ganguly D, Li H, Toombs JE, Girard L, Brekken RA, Minna JD. Tumor Cells Modulate Macrophage Phenotype in a Novel In Vitro Co-Culture Model of the NSCLC Tumor Microenvironment. J Thorac Oncol. 2022 Oct;17(10):1178-1191. doi: 10.1016/j.jtho.2022.06.011. Epub 2022 Jul 5. PMID: 35798240; PMCID: PMC9529910.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35798240/

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