01.透化組織或細(xì)胞與分離的線粒體（pti、pce與imt）

1.1. 一般注意事項(xiàng)

1. 呼吸量通常與分離線粒體（imt）中的線粒體蛋白量或透化組織（pti；包括滲透肌纖維pfe）中的組織量有關(guān)，而在活細(xì)胞和滲透細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞的O2流量通常是歸一化的。需要注意，對每個(gè)線粒體蛋白的呼吸通量變化的解釋是不同的，每質(zhì)量的組織是組織特異性，而不是線粒體特異性通量，每百萬細(xì)胞呼吸通量隨細(xì)胞大小變化，因此不能比較如血小板和成纖維細(xì)胞或心肌細(xì)胞。

2. 使用人體骨骼肌滲透性纖維（pfe）對進(jìn)行的呼吸檢測結(jié)果與imt的數(shù)據(jù)一致。

3. 將電子傳遞到呼吸系統(tǒng)的不同復(fù)合物、三羧酸循環(huán)的不同片段和轉(zhuǎn)運(yùn)體的特定底物，用于特定線粒體通路的功能評估。

4. 評估氧化磷酸化的最大能力需要底物組合，以重建生理三羧酸循環(huán)功能。

5. 很少有關(guān)于pfe的研究報(bào)道氧通量對不同底物濃度的依賴性，且pfe或pce和imt的直接比較也很少。

6. 因?yàn)槊舾行圆煌�，pce和pti的最佳解偶聯(lián)劑濃度不能從imt的研究中推斷出來。

1.2. 透化組織或細(xì)胞的優(yōu)勢 (pti、pce)

1. 與imt相比，pti需要更少的組織或更少的細(xì)胞。使用O2k，每次實(shí)驗(yàn)測試僅需1 mg 濕重的心臟纖維，或30萬個(gè)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞），在37°C的2 ml艙室中。

2. 與優(yōu)化pti相比，imt的優(yōu)化可能會(huì)花費(fèi)更多時(shí)間。

3. 所有類型的線粒體都可以在pti和pce中通過實(shí)驗(yàn)獲得，即imt制備允許分離不同的線粒體。

1.3.分離線粒體 (imt) 的優(yōu)勢

1. imt的制備需要分離和研究不同的線粒體亞群。

2. imt的混懸液代表組織樣本的平均值。

3.由于O2擴(kuò)散到非灌注纖維束中的線粒體，滲透肌纖維呼吸的氧依賴性增加了兩個(gè)數(shù)量級。因此，我們選擇imt來進(jìn)行線粒體氧動(dòng)力學(xué)的研究（小的懸浮細(xì)胞也是一個(gè)很好的模型）。在對肌肉纖維的研究中，必須嚴(yán)格避免低氧水平。電解產(chǎn)生的O2和H2O2滴定到含有H2O2的MiR06中，增加了O2k艙室內(nèi)的O2濃度。

4. ADP必須在高濃度下加入到pfi中，以達(dá)到最大的氧化磷酸化容量，因?yàn)閿U(kuò)散限制和線粒體外膜可能發(fā)揮不同于imt的屏障功能。

 

02.透化組織制備和呼吸測量

 

1. 機(jī)械組織分離的評價(jià)：機(jī)械組織分離必須使用適當(dāng)鋒利的鑷子，其分離程度可以通過觀察分離的纖維束的顏色的變化來評價(jià)（類似于肝組織），將培養(yǎng)皿放在深色背景上時(shí)，可更好的觀察到這一點(diǎn)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)實(shí)際限制可能是10-20 mg濕重的組織，隨后被分成2-5 mg的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 細(xì)胞膜的機(jī)械和化學(xué)透性：機(jī)械組織制備導(dǎo)致細(xì)胞膜的部分（骨骼�。┗蛲耆�（心肌、肝組織）透化。這種方法可能無法獲得完整的活細(xì)胞。部分透化的樣品需額外的化學(xué)透化（皂苷或洋地黃苷），通過標(biāo)準(zhǔn)化的孵育條件使線粒體外膜和內(nèi)膜保持完好無損。在僅僅是機(jī)械滲透的組織中，必須通過在氧化磷酸化狀態(tài)下的呼吸中添加皂苷或洋地黃苷來檢查樣品是否完全透化。在這些條件下，完全透化的細(xì)胞預(yù)計(jì)不會(huì)有呼吸刺激。

3. 在每次實(shí)驗(yàn)中測量1-2 mg組織的耗氧量需要高分辨率的呼吸測量。儀器對O2k的檢測極限為1pmolO2∙-1∙mL-1，直到空氣飽和。

4. 按照標(biāo)準(zhǔn)程序，實(shí)驗(yàn)前組織樣品的穩(wěn)定性通常是足夠的。通過將組織樣品保存在細(xì)胞保存培養(yǎng)基中可延長其穩(wěn)定性。因?yàn)橐恍┘?xì)胞在組織取樣期間被透化，可將透化后的樣品儲(chǔ)存時(shí)間最小化，或透化后保存在細(xì)胞保存培養(yǎng)基中以延長儲(chǔ)存時(shí)間。

呼吸檢測中樣品制備的穩(wěn)定性取決于高質(zhì)量線粒體呼吸介質(zhì)的應(yīng)用。高穩(wěn)定性允許應(yīng)用復(fù)雜的和擴(kuò)展的底物-解偶聯(lián)抑制劑滴定（SUIT）方案。