摘要
細(xì)胞生物能量代謝的調(diào)控被視為癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵驅(qū)動因素。鑒別調(diào)節(jié)生物能量代謝的關(guān)鍵通路是一種開發(fā)用于癌癥治療的新治療靶標(biāo)的頗具前景的策略。對活細(xì)胞中糖酵解和線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷 (ATP) 的速率進(jìn)行同步定量，為研究細(xì)胞生物能量代謝提供了重要視角。將安捷倫 Seahorse XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定試劑盒與最新的數(shù)據(jù)分析軟件相結(jié)合，應(yīng)用新型工作流程對調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝的藥劑進(jìn)行快速功能篩選。本應(yīng)用簡報(bào)介紹了 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定數(shù)據(jù)在選擇代謝調(diào)節(jié)劑和評估藥物效力方面所提供的豐富的信息。還展示了使用激酶抑制劑庫進(jìn)行抗癌藥物篩選的工作流程。該工作流程可用于鑒別靶向癌細(xì)胞代謝的藥物化合物或影響線粒體和糖酵解代謝的藥物靶標(biāo)。
 
 
前言
癌細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中會經(jīng)歷代謝重編程。針對癌細(xì)胞代謝特性尋找治療靶標(biāo)方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展^[1]。此外，更好地了解癌細(xì)胞代謝可以提供有關(guān)惡劣腫瘤微環(huán)境的寶貴信息，從而可大幅改善實(shí)體瘤新興免疫療法的療效^[2,3]。對于省時(shí)且穩(wěn)定的分析工具的需求也在不斷增長，以探索調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝的藥物靶標(biāo)和基因。
 
XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定能夠同時(shí)定量糖酵解和線粒體呼吸 ATP 產(chǎn)生速率。它使用 ATP 產(chǎn)生速率作為定量生物能量代謝活動的通用單位，對細(xì)胞能量表型進(jìn)行定量表征。該測定旨在通過連續(xù)進(jìn)樣寡霉素以及魚藤酮與抗霉素 A 的混合物來測量細(xì)胞的實(shí)時(shí)耗氧率和質(zhì)子釋放率。它能夠計(jì)算多個(gè)細(xì)胞生物能量代謝參數(shù)，包括來自單個(gè)樣品和測定的 (1) 線粒體 ATP 產(chǎn)生速率（mitoATP 速率）、(2) 糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率（glycoATP 速率）、(3) 總 ATP 產(chǎn)生速率（總 ATP 速率）和 (4) XF ATP 速率指數(shù)^[4]。
 
XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定是篩選和考察調(diào)節(jié)細(xì)胞生物能量代謝的候選物的強(qiáng)大工具，作為一種起始測定方法，它具有多項(xiàng)優(yōu)勢。首先，該測定提供了一種靈敏且直接的方法來檢測基礎(chǔ)代謝表型的變化。由于該測定同時(shí)測量兩條主要生物能量代謝通路的ATP 產(chǎn)生，因此能夠?qū)崟r(shí)快速鑒別線粒體呼吸與糖酵解之間碳源使用的切換。此外，通過利用兩種代謝活動的 ATP 產(chǎn)生速率的通用單位，可以通過兩個(gè)參數(shù)之間的占比（糖酵解百分比 vs. 氧化磷酸化百分比）或比率（ATP 速率指數(shù)）來定量評估代謝變化。

其次，這種實(shí)時(shí)分析能夠鑒別細(xì)胞代謝表型的動態(tài)變化，而通過廣泛使用的熒光或發(fā)光探針測量細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度則無法檢測到這些變化。在活細(xì)胞中，通過調(diào)整 ATP 產(chǎn)生和消耗的速率，細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)并維持在穩(wěn)態(tài)水平。換句話說，細(xì)胞通過響應(yīng)執(zhí)行任何細(xì)胞功能所需的 ATP 消耗的變化來增加或減少 ATP 的產(chǎn)生，反之亦然。由于細(xì)胞 ATP 水平的顯著改變表明發(fā)生了災(zāi)難性事件，因此它們僅適用于評估細(xì)胞活力^[5,6]。相比之下，使用 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定來實(shí)時(shí)測量ATP 產(chǎn)生速率能夠測量總細(xì)胞能量生成代謝的變化。這些變化可用于評估細(xì)胞功能（例如活化、分化等），以及區(qū)分對個(gè)體生物能量代謝通路的影響，盡管其對細(xì)胞活力沒有顯著影響。第三，由于它測量基礎(chǔ)代謝率，因此該測定僅需先后進(jìn)樣兩次試劑，且試劑具有寬最佳濃度范圍。無需額外的試劑優(yōu)化步驟。這一優(yōu)勢簡化了測定工作流程，特別是在篩選包含基因修飾的多個(gè)細(xì)胞系或細(xì)胞中的線粒體功能障礙時(shí)。最后，可用于該測定的定制軟件工具能夠快速定量測量由化學(xué)刺激或基因修飾引起的代謝干擾，包括篩選和劑量反應(yīng)分析功能。
 
 
實(shí)驗(yàn)部分
XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定
ATP 產(chǎn)生速率按照《XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定用戶指南》^[7]中所述進(jìn)行測量。
 
將 A549 (ATCC) 和 PC-9 (ECACC) 細(xì)胞在補(bǔ)充有 2 mmol/L GlutaMax (Gibco) 和 10% 胎牛血清 (FBS, HyClone) 的 RPMI 1640 (Gibco) 中培養(yǎng)。將細(xì)胞以 1 × 10⁴ 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到安捷倫 Seahorse XF Pro M 細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中，并培養(yǎng)過夜。測定當(dāng)天，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充有 10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L 丙酮酸鈉和 2 mmol/L 谷氨酰胺的 Seahorse XF RPMI 培養(yǎng)基 (pH 7.4)，在 37 °C 和不含 CO₂ 的條件下，將細(xì)胞分別在添加或不添加 1 µmol/L CB-839 或 BAY-876 的情況下孵育1 小時(shí)。測定結(jié)束后，使用 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)和安捷倫 Seahorse XF 成像和歸一化系統(tǒng)對細(xì)胞計(jì)數(shù)以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)歸一化。所有關(guān)鍵參數(shù)和圖表均使用Seahorse Analytics 生成。
 
表 1 列出了運(yùn)行 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定以進(jìn)行篩選和劑量反應(yīng)研究所需的安捷倫產(chǎn)品。有關(guān)所有培養(yǎng)基類型的完整列表以及我們針對每種檢測試劑盒的建議，請參閱《安捷倫 Seahorse XF 培養(yǎng)基選擇指南》^[8]。
  
激酶抑制劑庫篩選
將 THP-1 和 PBMC 細(xì)胞分別在補(bǔ)充有 10% FBS 和 β-巰基乙醇的 RPMI 1640（貨號 A1049101，Gibco）和 Immunocult-XF T 細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基（貨號 10981，STEMCELL Technologies）中培養(yǎng)。將細(xì)胞重懸于補(bǔ)充有 10 mmol/L 葡萄糖、1 mmol/L 丙酮酸鈉和 2 mmol/L 谷氨酰胺的 XF RPMI pH 7.4 測定培養(yǎng)基（安捷倫）中，并以 2 × 10⁵ 個(gè)細(xì)胞/孔接種到安捷倫 Seahorse XFe96/XF Pro PDL 板上。每次測定前，將細(xì)胞在含有1 µmol/L 或 10 µmol/L 的 80 種不同激酶抑制劑（SCREEN-WELL 激酶抑制劑庫，貨號 BML-2832，Enzo Life Sciences）的條件下孵育 1 小時(shí)，而溶劑對照組在含有 0.1% DMSO 的條件下孵育。
 
表 1. 用于篩選和劑量反應(yīng)分析的 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定所需的關(guān)鍵產(chǎn)品 * 貨號 103775-100 和 103777-100 包含安捷倫 Seahorse XF 探針板和 XF Pro M 細(xì)胞培養(yǎng)板 
** 貨號 103774-100 不包含進(jìn)行 XF 測定所需的 XF 探針板。只有當(dāng)需要其他孔板來優(yōu)化接種密度時(shí)才需要這個(gè)貨號的產(chǎn)品 
† 貨號 103799-100 不包含 XF 探針板。僅當(dāng)存在非貼壁血癌細(xì)胞或免疫細(xì)胞時(shí)才需要此貨號
 
使用安捷倫 Bravo 液體處理器進(jìn)行自動化測定設(shè)置
利用安捷倫 Bravo 液體處理器簡化測定前處理。在所有測定中使用 Bravo 進(jìn)行細(xì)胞清洗，每孔留 100 µL 的最終體積，為添加 100 µL 的 2x 預(yù)處理溶液做準(zhǔn)備。對于庫篩選，利用 Bravo 制備化合物，并在洗板后將化合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞板中。在此過程中使用的實(shí)驗(yàn)耗材如《Bravo Seahorse 實(shí)驗(yàn)工作臺用戶指南》所述^[9]。細(xì)胞清洗方案采用對《用于 Seahorse XFe96 樣品前處理的 Bravo 工作流程》^[10] 中的方案進(jìn)行修改后的方案。在 96 孔儲液槽中進(jìn)行連續(xù)稀釋和化合物庫稀釋，僅需一步即可轉(zhuǎn)移預(yù)處理溶液。加藥口采用手動加藥。如有需要，也可以使用 Bravo 完成此步驟。
 
CellTiter-Glo 測定
為測量總 ATP 水平，將 A549 或 PC-9 細(xì)胞以 2 × 10⁴ 個(gè)細(xì)胞接種到傳統(tǒng)白色 96 孔板 (Greiner) 中。暴露于代謝調(diào)節(jié)劑 1 小時(shí)后，根據(jù)制造商提供的手冊，使用 CellTiter-Glo (Promega) 試劑盒測量總 ATP 水平。

 
 
結(jié)果與討論
生物能量代謝表型變化的實(shí)時(shí)定量
如上所述，細(xì)胞內(nèi) ATP 水平或含量的測量常用于評估細(xì)胞活力。相比之下，在非致死或亞致死條件下，XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定可提供比 ATP 的靜態(tài)量更多的有關(guān)細(xì)胞代謝表型的信息。為證明該方法檢測不影響細(xì)胞內(nèi) ATP 水平的代謝變化的靈敏度，對兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系 A549 和 PC-9 在以下兩種代謝抑制劑中暴露 1 小時(shí)所獲得的結(jié)果進(jìn)行了比較：CB-839，一種谷氨酰胺合酶抑制劑 (Selleck Chemicals)；和 BAY-876，一種 Glut1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑 (Selleck Chemicals)。
 
圖 1A 顯示出在所示處理后測得的細(xì)胞內(nèi) ATP 水平的變化，表明在處理期間，無任何抑制劑導(dǎo)致測試的任一細(xì)胞系的細(xì)胞活力發(fā)生顯著變化。當(dāng)測量總 ATP 產(chǎn)生速率時(shí)，觀察到類似的結(jié)果，在細(xì)胞暴露于 CB-839 后，僅觀察到 ATP 產(chǎn)生速率發(fā)生小幅下降（圖 1B）。相比之下，當(dāng)單獨(dú)分析線粒體呼吸和糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率時(shí)，在暴露于 CB-839 和 BAY-876 后分別觀察到顯著下降，因?yàn)橄嗷ゴ�謝通路上調(diào)以補(bǔ)償抑制作用（圖 1C 和 1D）。因此，在這兩種細(xì)胞系中，用代謝抑制劑進(jìn)行處理導(dǎo)致細(xì)胞代謝表型發(fā)生了劇烈變化。CB-839 將細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦�偏向糖酵解的表型，�?BAY-876 則將細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦�偏向有氧的表型（圖 1E），而總產(chǎn)生速率幾乎保持不變（圖 1B）。
 

圖 1. 使用 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定檢測線粒體和糖酵解調(diào)節(jié)劑。將 A549 和 PC-9 細(xì)胞用溶劑對照 (0.1% DMSO)、1 µmol/L CB-839 或 1 µmol/L BAY-876 預(yù)處理 1 小時(shí)，并分析靜態(tài)細(xì)胞內(nèi) ATP 水平 (A) 和 ATP 產(chǎn)生速率（B 至 E）。(A) 利用 CellTiter-Glo 測得的細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度。(B) 總 ATP 產(chǎn)生速率。(C) 線粒體 ATP 產(chǎn)生速率。(D) 糖酵解 ATP 產(chǎn)生速率。(E) ATP 速率指數(shù)。（n = 6，平均值 ± SD）
 
此外，除監(jiān)測抑制劑所引起的代謝表型轉(zhuǎn)變以外，還可以定量比較通路特異性 ATP 產(chǎn)生速率的變化，并用于評價(jià)細(xì)胞對不同藥物的敏感性。由 CB-839 導(dǎo)致的 A549 的 mitoATP 產(chǎn)生速率和 ATP 速率指數(shù)的降低比 PC-9 的降低程度更大（圖 1C 和1E）。相比之下，與 A549 相比，響應(yīng) BAY-876 時(shí) PC-9 細(xì)胞的 glycoATP 產(chǎn)生速率降低更多，并且 ATP 速率指數(shù)變化更顯著（圖 1D 和 1E）。
 
通過執(zhí)行劑量反應(yīng)測定，能夠更清晰地評價(jià)這些敏感性差異（圖 2）。響應(yīng) CB-839 處理時(shí)的 mitoATP 速率變化的劑量反應(yīng)研究顯示，A549 中的 IC₅₀ 為 PC-9 中的 1/50 以下（圖 2A）。相比之下，與 PC-9 相比，A549 中 BAY-876 的glycoATP 速率的 IC₅₀ 高出八倍多（圖 2B）。
 
抗癌代謝調(diào)節(jié)劑篩選
作為一種簡單而穩(wěn)定的代謝表型測定，XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定非常適合篩選和評價(jià)代謝靶標(biāo)候選藥物的藥物效力。例如，我們使用激酶抑制劑庫來篩選癌細(xì)胞特異性線粒體調(diào)節(jié)劑。其工作流程如圖 3 所示。簡而言之，評價(jià)了來自 SCREEN-WELL 激酶抑制劑庫 (Enzo Life Sciences) 的 80 種激酶抑制劑對THP-1 細(xì)胞（一種急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系）和外周血單核細(xì)胞 (PBMC)（一種非癌細(xì)胞對照組）的代謝干擾。比較了它們與選定的表現(xiàn)出顯著獨(dú)特效果的抑制劑對細(xì)胞能量代謝的抑制作用。使用 Project 工具組合來自三個(gè)獨(dú)立篩選重復(fù)測定的數(shù)據(jù)，該工具是 Seahorse Analytics 軟件中的一種多文件分析功能，有助于鑒別在 THP-1 和 PBMC 中表現(xiàn)出不同反應(yīng)的候選藥物。此外，通過比較兩種細(xì)胞類型的劑量反應(yīng)，進(jìn)一步評價(jià)了選定化合物的效力。
 
所有數(shù)據(jù)分析均采用 Seahorse Analytics 軟件，該軟件提供ATP 的產(chǎn)生速率工作流程簡化了早期藥物發(fā)現(xiàn)中篩選化合物和劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)解析。
 

圖 2. A549 與 PC-9 細(xì)胞系之間對代謝抑制劑敏感性的比較。如圖所示，在 Agilent XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定之前，將 A549 和 PC-9 細(xì)胞用 CB-839 或BAY-876 預(yù)處理 1 小時(shí)。利用安捷倫 Seahorse Analytics 中的 XF ATP 速率劑量分析工具對 IC50 值進(jìn)行評估。(A) mitoATP 速率對 CB-839 的劑量反應(yīng)。(B) glycoATP 速率對 BAY-876 的劑量反應(yīng)。(n = 4，平均值 ± SD）

圖 3. 提出的篩選靶向細(xì)胞代謝的抗癌藥物的工作流程。通過多個(gè)針對每種細(xì)胞類型的獨(dú)立的 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定來評價(jià)化合物對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 (THP-1) 和對照細(xì)胞(PBMC) 的影響。根據(jù)安捷倫 Seahorse Analytics 中的調(diào)節(jié)劑排名，對重復(fù)測定進(jìn)行組合和比較。利用劑量反應(yīng)研究進(jìn)一步分析藥物效力，以選擇對 THP-1 靶細(xì)胞具有特異性的代謝調(diào)節(jié)劑 
  
 
藥物效力評價(jià)
 
圖 4 示出在 THP-1 細(xì)胞中獲得的三次重復(fù)篩選測定結(jié)果的代表性數(shù)據(jù)。每種化合物對 ATP 產(chǎn)生速率的上調(diào)和下調(diào)可以用各種圖形格式（包括條形圖和熱圖）表示，因此用戶可以快速鑒別最有效的代謝調(diào)節(jié)劑。此外，ATP 速率 指數(shù)（以mitoATP 產(chǎn)生速率與 glycoATP 產(chǎn)生速率之間的比率計(jì)算）圖能夠檢測導(dǎo)致向線粒體呼吸（指數(shù)增加）或糖酵解表型（指數(shù)減�。┑娘@著代謝變化的藥物或狀況，可以顯示或?qū)С鰹殡娮颖砀褚怨┻M(jìn)一步分析。
 

圖 4. 篩選干擾癌細(xì)胞能量代謝的激酶抑制劑。在安捷倫 Seahorse XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定之前，將 THP-1 細(xì)胞暴露于各種激酶抑制劑 (n = 80) 1 小時(shí)。(A) 比較對線粒體、糖酵解和總 ATP 產(chǎn)生速率的影響。(B) 使用 ATP 速率指數(shù)比較激酶抑制劑誘導(dǎo)的能量表型變化
  
此外，由重復(fù)測定得到的不同輸出參數(shù)的平均組合數(shù)據(jù)可以按升序或降序排序，從而允許根據(jù)測得的任何參數(shù)的影響對激酶抑制劑進(jìn)行排序。如圖 5 所示，當(dāng)獲得的 mitoATP 速率按降序排序時(shí)，一些激酶抑制劑顯著抑制 THP-1 細(xì)胞中的 mitoATP 產(chǎn)生速率（圖 5A），而較少數(shù)量的抑制劑看起來能夠有效抑制 PBMC 中的 mitoATP 速率（圖 5B）。通過比較對 mitoATP 產(chǎn)生速率和 ATP 速率指數(shù)的影響，選中幾種抑制劑。例如，SU1498 是對 THP-1 細(xì)胞的 mitoATP 產(chǎn)生具有最強(qiáng)抑制作用的化合物之一，而對 PBMC 幾乎沒有影響，對癌細(xì)胞類型表現(xiàn)出高特異性。U0126 對 mitoATP 速率表現(xiàn)出中度影響，但對 THP-1 細(xì)胞也具有高特異性。相比之下，AG-879 對于兩種細(xì)胞類型均有效，并且在 PBMC 中的作用略強(qiáng)。圖 5C 顯示出從 Seahorse Analytics 中排序的圖表導(dǎo)出的mitoATP 速率的數(shù)據(jù)表視圖。
 
已知 SU1498 能夠抑制 VEGFR2 受體和相關(guān)信號傳導(dǎo)并誘導(dǎo)線粒體功能障礙^[11,12]。MEK 抑制劑 U0126 被視為一種潛在的抗白血病藥劑，并且據(jù)報(bào)道能夠抑制線粒體功能并以不依賴于MEK 的方式誘導(dǎo)代謝表型轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒?sup>[13,14]。據(jù)報(bào)道，ErbB2 激酶抑制劑 AG-879 可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但其對線粒體代謝的影響尚未得到充分研究。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道，它在高濃度下能夠抑制 Glut1 活性^[15]。利用劑量反應(yīng)研究，對這三種藥物的效力進(jìn)行了評價(jià)（圖 6）。與預(yù)期一致，THP-1 與 PBMC 對 AG-879 的敏感性無顯著差異。相比之下，SU1398 和 U0126 僅在 THP-1 細(xì)胞中有效抑制線粒體呼吸。三種藥物都會誘導(dǎo)代謝變化，糖酵解活性相互增加，并且在短期孵育后對細(xì)胞活力無顯著影響。
 

圖 5. THP-1 選擇性抗線粒體化合物的鑒別。根據(jù)對 THP-1 (A) 和 PBMC (B) 的 mitoATP 速率的影響對抑制劑進(jìn)行排名。在安捷倫 Seahorse Analytics 中，將每個(gè)排序的數(shù)據(jù)集導(dǎo)出到 Microsoft Excel 電子表格文件中，并且突出顯示了三種化合物 (C)。（n = 3，平均值 ± SEM）
 

圖 6. THP-1 和 PBMC 的 mitoATP 速率 (A) 和 glycoATP 速率 (B) 對三種選定激酶抑制劑的劑量反應(yīng)。（n = 4，平均值 ± SD）
 
 
結(jié)論
安捷倫 XF 實(shí)時(shí) ATP 速率測定是一種簡單而穩(wěn)定的檢測方法，能夠在癌癥藥物發(fā)現(xiàn)過程中鑒別相關(guān)代謝靶標(biāo)通路。與專用分析軟件相結(jié)合，提供了一種直接的方法來定量和比較癌細(xì)胞由于化學(xué)品或基因修飾引起的代謝改變，并區(qū)分線粒體與糖酵解能量代謝。該測定適合作為篩選可誘導(dǎo)癌細(xì)胞代謝表型變化而對細(xì)胞活力無顯著影響的化合物的起始測定方法。此外，可以使用劑量反應(yīng)測定來評價(jià)選定化合物的效力，或進(jìn)行更全面的功能分析，以實(shí)現(xiàn)更詳細(xì)的臨床前研究。
 
 
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僅供科研使用，不用于臨床診斷用途。