乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，從局部上皮細(xì)胞的癌變轉(zhuǎn)移進(jìn)展為遠(yuǎn)端器官部位的繼發(fā)腫瘤。轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)中的所有步驟都涉及腫瘤細(xì)胞與其遇到的不同動(dòng)態(tài)微環(huán)境之間的機(jī)械相互作用，包括暴露于流體流動(dòng)。腫瘤細(xì)胞會(huì)遇到兩種類型的流體流動(dòng)：腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)液流動(dòng)（interstitial flow）和血管或淋巴微環(huán)境中的流體流動(dòng)（fluid flow）。盡管已知流體流動(dòng)會(huì)顯著影響癌細(xì)胞的行為，但關(guān)于血管微環(huán)境中力的幅度如何影響癌癥進(jìn)展期間的細(xì)胞事件的信息并不多。0.1-1 Pa幅度的機(jī)械力已被證明通過激活信號(hào)通路和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子來影響細(xì)胞表型，其中一些因子有EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）有關(guān)。

EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮表型，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過程，期間細(xì)胞的粘附和力學(xué)特性發(fā)生顯著改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與原發(fā)腫瘤的分離。TGF-β通路以其參與癌細(xì)胞中的EMT而聞名。了解流體流動(dòng)等機(jī)械力如何促進(jìn)EMT和轉(zhuǎn)移事件，將有助于識(shí)別可用于促進(jìn)乳腺癌早期診斷和分類的關(guān)鍵基因，從而更好地確定患者的治療方案。

一旦腫瘤細(xì)胞在血流的生物物理學(xué)力作用下存活下來，它必須粘附在繼發(fā)性腫瘤形成部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，外滲，并在開始生長之前存活。癌細(xì)胞粘附需要在癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)同源配體和受體，特別是整合素、膠原蛋白、選擇素和活化的白細(xì)胞細(xì)胞粘附分子（ALCAM）。其中一些粘附分子已被證明在癌癥進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，然而，沒有研究調(diào)查乳腺癌細(xì)胞先前暴露于血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力如何影響參與促進(jìn)隨后粘附到內(nèi)皮細(xì)胞的基因的表達(dá)。

在加拿大卡爾加里大學(xué)細(xì)胞和分子生物工程研究實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，利用平行板流動(dòng)室組成的生物反應(yīng)器系統(tǒng)將乳腺癌細(xì)胞暴露于中等水平的流體流動(dòng)中，基因表達(dá)分析用于評(píng)估血流誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的變化，網(wǎng)絡(luò)分析用于確定參與促進(jìn)EMT和細(xì)胞粘附的基因之間的關(guān)鍵相互作用。研究人員假設(shè)以流體流動(dòng)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力刺激乳腺癌細(xì)胞會(huì)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，此外，還評(píng)估了流動(dòng)刺激和未刺激的乳腺癌細(xì)胞在體外粘附內(nèi)皮細(xì)胞單層的能力。相關(guān)成果發(fā)表在 Breast Cancer Research 期刊題為“Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells”。
 

流體流動(dòng)影響乳腺癌細(xì)胞系基因表達(dá)并富集參與轉(zhuǎn)移的細(xì)胞過程

為了研究流體流動(dòng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系基因表達(dá)的影響，將BT-474、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞暴露于1 Pa大小的剪切流中。分析全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)時(shí)，觀察到流動(dòng)暴露和非暴露細(xì)胞之間的基因表達(dá)譜存在顯著差異（圖1 a）。剪切力暴露時(shí)，每個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中至少有150個(gè)基因差異表達(dá)（圖1 b）。MDA-MB-231基底細(xì)胞系在流動(dòng)刺激下具有差異表達(dá)最多的基因（圖1 b）�；�底細(xì)胞乳腺癌是乳腺癌最具侵襲性的亞型之一，具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，其特征是早期轉(zhuǎn)移模式。

為了確定受流動(dòng)暴露顯著影響的關(guān)鍵分子功能和生物過程，進(jìn)行了基因集富集分析。參與導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展的細(xì)胞過程的基因亞群在流動(dòng)刺激下在大多數(shù)細(xì)胞系中深度富集。在所有暴露于流動(dòng)的乳腺癌細(xì)胞中，觀察到參與調(diào)節(jié)EMT（圖1 c），正調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（圖1 d），調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)粘附（圖1 e），以及正調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附（圖1 f）的基因顯著富集。此外，觀察到幾種膠原蛋白，整合素和其他細(xì)胞粘附分子（包括FN1和ALCAM）的上調(diào)，表明在流動(dòng)暴露時(shí)癌細(xì)胞粘附性能的調(diào)節(jié)。

圖1   （a）靜態(tài)和流動(dòng)暴露的MDA-MB-231，BT-474，SK-BR-3和MCF-7乳腺癌細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的熱圖。（b）靜態(tài)和流動(dòng)暴露乳腺癌細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的數(shù)量。乳腺癌細(xì)胞暴露于流體中，參與轉(zhuǎn)移進(jìn)展的分子過程豐富，包括上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)（c）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)（d）、細(xì)胞-細(xì)胞粘附的正調(diào)節(jié)（e）和細(xì)胞-基質(zhì)粘附的調(diào)節(jié)（f）。

流體流動(dòng)上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中EMT基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究血流刺激時(shí)的EMT調(diào)節(jié)，分析了由人EMT的PCR陣列創(chuàng)建的EMT基因集中的基因表達(dá)。數(shù)據(jù)分析揭示了每個(gè)乳腺癌細(xì)胞系在流動(dòng)刺激后差異表達(dá)的EMT基因的熱圖，包括EMT誘導(dǎo)因子如FN1、SNAI2、SERPINE1、NOTCH1、TCF4、MMP2、PLAU、WNT5A和WNT5B的一致上調(diào)。EMT抑制因子，如KRT19和TSPAN13在幾種細(xì)胞系中下調(diào)。此外，觀察到在MDA-MB-231細(xì)胞中，在0.2 Pa和0.6 Pa的較低剪切應(yīng)力刺激和停止刺激后，流動(dòng)誘導(dǎo)的SNAI2上調(diào)持續(xù)了24小時(shí)。

此外，還比較了MDA-MB-231細(xì)胞的靜態(tài)和流動(dòng)來源的EMT蛋白表達(dá)譜。在流動(dòng)刺激的MDA-MB-231細(xì)胞中，通過同時(shí)上調(diào)Snail和Vimentin來促進(jìn)EMT。這些發(fā)現(xiàn)與VIM和SNAI2的qPCR表達(dá)數(shù)據(jù)一致，VIM和SNAI2分別編碼Vimentin和Snail。E-鈣黏蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞中以低水平表達(dá)。此外，還觀察到在MCF-7和BT-474細(xì)胞的流動(dòng)暴露中CDH1輕微或沒有下調(diào)，CDH2上調(diào)，表明向更多的間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變。

接下來，比較了在化學(xué)誘導(dǎo)EMT、流體流動(dòng)刺激或在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的HMECs（人乳腺上皮細(xì)胞）中E-鈣黏蛋白、Vimentin和Snail的表達(dá)水平。與靜態(tài)對(duì)照相比，Snail 和Vimentin在流動(dòng)暴露和EMT誘導(dǎo)的細(xì)胞中均上調(diào)，而E-鈣黏蛋白在三種條件下的表達(dá)沒有顯著差異，流動(dòng)刺激的HMECs中SNAI2和VIM上調(diào)，CDH1變化不顯著。這些結(jié)果表明，將HMECs暴露于流體流動(dòng)會(huì)刺激向EMT表型的進(jìn)展，類似于化學(xué)誘導(dǎo)。

Smad3 而非 smad2 敲低影響流動(dòng)誘導(dǎo)的 SNAI2 上調(diào)

Smad2/3是癌癥中EMT的已知調(diào)節(jié)劑，也已知具有血流反應(yīng)性。在MDA-MB-231細(xì)胞中測量Smad2水平，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)暴露后降低（圖2）。為了研究Smad2或Smad3參與血流誘導(dǎo)的SNAI2上調(diào)，用Smad2或Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。SNAI2在對(duì)照和轉(zhuǎn)染Smad2 siRNA的細(xì)胞中分別上調(diào)2.2和2.8倍。當(dāng)用Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，差異表達(dá)不顯著（1.4倍）。用Smad2和Smad3轉(zhuǎn)染分別導(dǎo)致 91% 和 86% 的敲低。

圖2   （a）在MDA-MB-231細(xì)胞中通過蛋白質(zhì)印跡測定的Smad2蛋白表達(dá)（總SMAD2和pSmad2-連接物）。（b）對(duì)照（-），Smad2或Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染并用流體流動(dòng)刺激20小時(shí)的MDA-MB-231細(xì)胞中SNAI2表達(dá)的定量RT-PCR分析。

網(wǎng)絡(luò)分析揭示了參與細(xì)胞流動(dòng)反應(yīng)的關(guān)鍵基因

為了可視化可能參與促進(jìn)流動(dòng)刺激乳腺癌細(xì)胞中EMT和細(xì)胞粘附的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件平臺(tái)導(dǎo)入并分析了流動(dòng)暴露和靜態(tài)對(duì)照的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明，當(dāng)乳腺癌細(xì)胞暴露于流動(dòng)刺激時(shí)，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)高度模塊化。由于FN1在大多數(shù)流動(dòng)暴露細(xì)胞中的過表達(dá)及其在EMT和細(xì)胞粘附中的作用，因此分析了其相互作用子網(wǎng)絡(luò)，以更好地了解流動(dòng)刺激如何影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移事件。MDA-MB-231和 MCF-7 的FN1子網(wǎng)絡(luò)揭示了FN1過表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT和粘附的功能聯(lián)系。
 

生物反應(yīng)器衍生的表達(dá)變化概括了臨床乳腺癌基因表達(dá)譜

為了研究實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)與人類乳腺癌進(jìn)展的相關(guān)性，使用癌癥基因組圖譜（TCGA）的數(shù)據(jù)分析了FN1及其PLAU和ALCAM的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。與健康志愿者相比，F(xiàn)N1，PLAU和ALCAM在大多數(shù)乳腺癌亞型患者中上調(diào)，大多數(shù)乳腺癌階段患者的FN1，PLAU和ALCAM也上調(diào)。

接下來，在2878例患者的乳腺腫瘤微陣列數(shù)據(jù)集中評(píng)估FN1、PLAU和ALCAM的預(yù)后價(jià)值。與FN1和PLAU表達(dá)低的患者相比，F(xiàn)N1和PLAU表達(dá)高的患者的生存率降低。ALCAM表達(dá)的生存圖顯示出類似的模式。

流體流動(dòng)刺激增加乳腺癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲能力

最后，評(píng)估了流動(dòng)刺激和未刺激的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞粘附在內(nèi)皮單層上的能力。圖3 a顯示了在未刺激和流動(dòng)刺激的MDA-MB-231細(xì)胞流過內(nèi)皮單層后獲得的癌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附圖像。在超過4分鐘的所有時(shí)間點(diǎn)，流動(dòng)刺激的MDA-MB-4細(xì)胞比未刺激的細(xì)胞更多的粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上（圖3 a、b）。此外，與未刺激的細(xì)胞相比，流動(dòng)刺激的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在靜態(tài)粘附實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)皮單層的更強(qiáng)粘附（圖3 c）。此外，還觀察到MDA-MB-231（圖3 d）和 MCF-7（圖3 e）細(xì)胞在流動(dòng)刺激后，一組關(guān)鍵的癌細(xì)胞粘附基因顯著上調(diào)。Transwell遷移和侵襲測定用于研究流動(dòng)刺激和未刺激細(xì)胞的遷移和侵襲能力。圖3 f表明MDA-MB-231細(xì)胞暴露于流體流動(dòng)會(huì)增加它們通過Transwell膜遷移和侵襲的能力�？傊�，這些結(jié)果揭示了暴露于流體流動(dòng)在增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的遷移、粘附到內(nèi)皮細(xì)胞和通過膜侵襲方面的潛在作用。

圖3   （a）未刺激和血流刺激的MDA-MB-231細(xì)胞在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)粘附在內(nèi)皮單層的代表性相襯圖像。流動(dòng)（b）和靜態(tài)（c）粘附研究中流動(dòng)刺激（黑線）和未刺激（灰線）細(xì)胞的相對(duì)粘附。靜態(tài)和流動(dòng)暴露的MDA-MB-231（d）和MCF-7（e）乳腺癌細(xì)胞之間差異表達(dá)的細(xì)胞粘附基因的熱圖。（f）transwell 測定中流動(dòng)刺激和未刺激的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲比較。

總之，該研究使用平行平板流室系統(tǒng)，創(chuàng)建了一個(gè)乳腺癌進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，并鑒定了在患者群體中差異表達(dá)的生物標(biāo)志物，表明1 Pa左右的流體剪切力可促進(jìn)EMT和乳腺癌細(xì)胞與內(nèi)皮單層的粘附，并且已鑒定的生物標(biāo)志物在患者群體中明顯表達(dá)。研究了解剪切應(yīng)力等生物物理力如何影響乳腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展所涉及的細(xì)胞過程對(duì)于識(shí)別疾病進(jìn)展的新分子標(biāo)志物和預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持使用基于流動(dòng)的模型來進(jìn)一步研究流體環(huán)境如何影響癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移能力。該研究結(jié)果表明，體外模型允許識(shí)別生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可用于識(shí)別已經(jīng)經(jīng)歷EMT的細(xì)胞以及可能正在循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。使用該系統(tǒng)研究涉及乳腺癌發(fā)展和進(jìn)展的細(xì)胞事件可能會(huì)為轉(zhuǎn)移性乳腺癌提供新的診斷和治療方法。

參考文獻(xiàn)：Fuh KF, Shepherd RD, Withell JS, Kooistra BK, Rinker KD. Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells. Breast Cancer Res. 2021 Oct 12;23(1):97. doi: 10.1186/s13058-021-01473-0. PMID: 34641959; PMCID: PMC8507133.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34641959/

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