血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細胞（ECs）從流動的血液中感知流體剪切應(yīng)力（FSS），以調(diào)節(jié)數(shù)千種基因的表達并深刻影響EC表型。動脈粥樣硬化的一個主要模式是可溶性炎癥介質(zhì)和剪切應(yīng)激之間的協(xié)同作用，如高FSS阻斷炎癥轉(zhuǎn)錄通路的激活，如NF-kB（核因子κB）和c-Jun N-末端激酶，而低剪切應(yīng)力允許或增強這些反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄因子KLF2由高FSS強烈誘導(dǎo)，并被認為介導(dǎo)其抗動脈粥樣硬化作用的很大一部分。

研究發(fā)現(xiàn)，由TGFβ（轉(zhuǎn)化生長因子β）分泌升高和ECs對TGFβ的敏感性增加驅(qū)動的內(nèi)皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）是動脈粥樣硬化的主要原因。重要的是，TNFα（腫瘤壞死因子α）、白細胞介素1β（IL1β）和γ干擾素等細胞因子使ECs對TGFβ敏感，從而促進EndMT。事實上，TGFβ受體的內(nèi)皮特異性敲除可顯著減小斑塊大小，甚至誘導(dǎo)斑塊消退，這支持TGFβ信號通路在動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展中的作用。

在美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科心血管研究中心、細胞生物學(xué)系、生物醫(yī)學(xué)工程系團隊的以往研究中表明，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2/3的激活和核易位在低FSS下顯示出明顯的最大值，這歸因于一個敏感的激活機制，該機制由 ≈1 dyne/cm2 的剪切力觸發(fā)，并被 >15 dyne/cm2的高FSS抑制。然而，這些影響在炎癥和動脈粥樣硬化背景下的更廣泛意義尚未得到探索。因此，該團隊進一步探索了高FSS在調(diào)控TGFβ-Smad2/3-EndMT通路以響應(yīng)可溶性致動脈粥樣硬化生成因子中的作用，相關(guān)成果發(fā)表在Journal of the American Heart Association 題為High Fluid Shear Stress Inhibits Cytokine-Driven Smad2/3 Activation in Vascular Endothelial Cells。
 

首先，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的HUVECs在4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2 的FSS或0.5±4 dynes/cm2 的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）下添加TGFβ2或不添加的處理條件下持續(xù)6小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ2單獨誘導(dǎo)了強烈的Smad2/3核易位，并在低FSS或OSS下進一步增加，但幾乎完全被高FSS阻斷（圖1 A、B）。此外還測量了與間充質(zhì)表型相關(guān)的Smad2/3靶基因，特別是FN1（纖連蛋白1）、N-鈣粘蛋白、ID1（DNA結(jié)合抑制劑）、Snail2（蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2）和MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）；還研究了細胞間粘附分子1（ICAM-1），它在動脈粥樣硬化中介導(dǎo)白細胞募集到動脈壁，并由Smad2/3和NF-kB誘導(dǎo)。結(jié)果表明，低FSS對TGFβ的反應(yīng)略有增加，而高FSS基本上消除了TGFβ誘導(dǎo)的Smad2/3靶基因的表達（圖1 C）。因此，高FSS抑制TGFβ信號通路。

炎癥介質(zhì)在激活動脈粥樣硬化中的EC Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，主要是使細胞對TGFβ敏感。因此，實驗將HUVECs用炎性細胞因子IL1β處理，施加或不施加4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2  的FSS或 0.5±4 dynes/cm2 的OSS并持續(xù)12小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL1β單獨誘導(dǎo)Smad2/3核易位，在LSS或OSS下進一步增加，但基本上完全被高FSS抑制。使用TNFα處理觀察到幾乎相同的結(jié)果。Smad2/3靶基因的測定證實了這些發(fā)現(xiàn)。因此，炎癥誘導(dǎo)的Smad2/3信號傳導(dǎo)也受到高FSS的抑制。

圖1   FSS在體外阻止TGFβ2誘導(dǎo)的Smad2/3信號通路。

接下來，為了在體內(nèi)驗證這些結(jié)果，實驗檢測了注射TGFβ的小鼠的高FSS /動脈粥樣硬化保護區(qū)域和低FSS /動脈粥樣硬化易感區(qū)域的內(nèi)皮反應(yīng)，分別使用主動脈的外彎曲和內(nèi)彎曲作為高和低/振蕩FSS區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ強烈誘導(dǎo)內(nèi)彎曲Smad2/3核易位，但在外彎曲作用微弱（圖2 A、B）。對Smad2/3誘導(dǎo)基因，纖連蛋白和ICAM-1的檢測表明，TGFβ同樣誘導(dǎo)它們在內(nèi)彎曲而不是外彎曲中的表達（圖2 C-F）。因此，體內(nèi)效果與體外效果呈相關(guān)性。

此外，實驗同樣試圖驗證IL1β和TNFα在體內(nèi)的影響。向小鼠注射炎性細胞因子（IL1β和TNFα），隨后在主動脈的不同區(qū)域檢查Smad2/3核易位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL1β和TNFα均誘導(dǎo)Smad2/3在內(nèi)彎曲中易位，但在外彎曲中沒有；IL1β和TNFα誘導(dǎo)的Smad2/3誘導(dǎo)蛋白，纖連蛋白和ICAM-1同樣在內(nèi)彎曲而不是外彎曲中表達。因此，體內(nèi)Smad2/3信號傳導(dǎo)的激活與低FSS區(qū)域相關(guān)，并且在高FSS區(qū)域中基本上無法檢測到。

圖2   FSS抑制體內(nèi)TGFβ信號傳導(dǎo)。
 

最后，為了確認細胞因子誘導(dǎo)的基因表達通過Smad2/3發(fā)生，實驗利用siRNA介導(dǎo)的敲低在HUVECs中沉默Smad2/3，然后用TGFβ2或IL1β在4 dynes/cm2 或25 dynes/cm2 的FSS下處理ECs，并采用定量PCR分析基因表達。結(jié)果表明，Smad2/3敲低在所有條件下阻斷了TGFβ2-和IL1β-誘導(dǎo)的FN1和N-鈣粘蛋白的增加（圖3 A、B）。因此，這些基因在ECs中的表達是Smad2/3依賴性的，Smad2/3在體外介導(dǎo)細胞因子誘導(dǎo)的基因表達。
 

圖3   Smad2/3敲低阻斷TGFβ2或IL1β誘導(dǎo)的體外基因表達。

總之，該研究表明，低和振蕩FSS增強，而高FSS抑制Smad2/3信號傳導(dǎo)和間充質(zhì)和炎癥基因的表達，以響應(yīng)TGFβ和炎性細胞因子（IL1β和TNFα）。因此，這些結(jié)果更新并擴展了高流量通過其對炎癥途徑的影響抑制動脈粥樣硬化發(fā)生的主要模式，包括最近闡明的TGFβ-Smad2/3-EndMT機制。這些結(jié)果闡明了一種控制動脈粥樣硬化病變部位選擇性的新機制。低和紊亂的FSS通過細胞因子放大Smad2/3活化，而高FSS則有效抑制。因此，這些作用導(dǎo)致在血液流量低而趨于紊亂的區(qū)域優(yōu)先形成動脈粥樣硬化斑塊，炎癥和EndMT之間的正反饋促進疾病進展。

參考文獻：Deng H, Schwartz MA. High Fluid Shear Stress Inhibits Cytokine-Driven Smad2/3 Activation in Vascular Endothelial Cells. J Am Heart Assoc. 2022 Jul 19;11(14):e025337. doi: 10.1161/JAHA.121.025337. Epub 2022 Jul 15. PMID: 35861829; PMCID: PMC9707828.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35861829/
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