電穿孔是用于轉(zhuǎn)移非病毒載體以及將其他分子（DNA、藥物、RNA 或蛋白質(zhì)）引入靶細(xì)胞的技術(shù)之一。這種方法通過對(duì)細(xì)胞施加短持續(xù)時(shí)間和高電壓的電場(chǎng)，當(dāng)電脈沖超過膜電容時(shí)，其穩(wěn)定性會(huì)受到影響并形成瞬時(shí)的可逆孔隙，分子可以通過這些孔隙進(jìn)入細(xì)胞。利用電穿孔技術(shù)進(jìn)行對(duì)細(xì)胞或活體的電轉(zhuǎn)染是一種現(xiàn)今常用的將DNA、siRNA 等分子輸送到細(xì)胞中的簡(jiǎn)單有效的方法。利用電穿孔進(jìn)行的轉(zhuǎn)染對(duì)比其他方法，不僅操作簡(jiǎn)單快速、無需添加專用試劑、適用性廣，而且其轉(zhuǎn)染率高、無需考慮安全因素，在瞬時(shí)完成轉(zhuǎn)染過程的同時(shí)達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的。

每種細(xì)胞類型需要的電轉(zhuǎn)條件略有不同，需要更優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果必須通過實(shí)驗(yàn)確定電轉(zhuǎn)條件。有的細(xì)胞如原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等會(huì)出現(xiàn)較難轉(zhuǎn)染的情況。而對(duì)于難轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞，電穿孔是唯一成功用于將各種分子高效轉(zhuǎn)移到非貼壁細(xì)胞系中的技術(shù)。由于大多數(shù)轉(zhuǎn)染方法對(duì)非貼壁細(xì)胞難以進(jìn)行，所以對(duì)靶基因的電轉(zhuǎn)成為將目的基因引入懸浮細(xì)胞的常見策略。在電轉(zhuǎn)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)快速有效的優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件，可以高效且一致地將核酸遞送到細(xì)胞中，同時(shí)保持細(xì)胞活力。

 

《Systemic Optimization of Gene Electrotransfer Protocol Using Hard-to-Transfect UT-7 Cell Line as a Model》是立陶宛健康科學(xué)大學(xué)腫瘤研究所腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室在2022年11月發(fā)表于Biomedicines的文章。該實(shí)驗(yàn)以UT-7這種轉(zhuǎn)染效率很低的懸浮細(xì)胞為例，討論對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方案的條件優(yōu)化，以平衡盡可能高的轉(zhuǎn)染效率與電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞活力和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。其中關(guān)于電轉(zhuǎn)染過程的系統(tǒng)優(yōu)化可以為我們?cè)陔娹D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中探索難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件提供參考方法與改進(jìn)方向。

實(shí)驗(yàn)對(duì)UT-7 細(xì)胞系進(jìn)行質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)，將編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP用作評(píng)估轉(zhuǎn)染效率的指標(biāo)。通過進(jìn)行不同的電穿孔參數(shù)的多組實(shí)驗(yàn)，包括電脈沖方案的配置（振幅、持續(xù)時(shí)間、電壓和脈沖數(shù)）、DNase抑制劑、DNA/RNA濃度等，系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染率且高細(xì)胞活性的電轉(zhuǎn)移。

結(jié)果分析

評(píng)估電轉(zhuǎn)染結(jié)果的方法

01

在不同脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間條件下 pEGFP 基因電轉(zhuǎn)后 UT-7 細(xì)胞的活力，通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)、MTS 測(cè)定和 PI 染色進(jìn)行評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)建立了一種門控策略，用于正確評(píng)估與 PI 共染色的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以區(qū)分樣品中四種不同的細(xì)胞亞群：轉(zhuǎn)染/活 (pEGFP+/PI-)、 未轉(zhuǎn)染/活 (pEGFP-/PI-)、 轉(zhuǎn)染/死亡 (pEGFP + /PI+) 和未轉(zhuǎn)染/死亡 (pEGFP-/PI+)。門控策略首先通過根據(jù)前向散射面積 (FSC-A) 與前向散射高度 (FSC-H) 的光學(xué)特性繪制細(xì)胞的流式散點(diǎn)圖，如圖1A。然后從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(GFP-)中分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞 (GFP+)，如圖1B。從死細(xì)胞 (PI+)中分離活細(xì)胞 (PI-)，如圖1C。由于無補(bǔ)償情況下GFP熒光會(huì)溢出到PI通道，如圖1E。所以在GFP通道中使用了6%的補(bǔ)償，如圖1F。

通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)、MTS 測(cè)定和 PI 染色以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，從而對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活率進(jìn)行評(píng)估，利用三種不同的測(cè)定法來確定 UT-7 細(xì)胞的活力。因?yàn)闊o法在不丟失活細(xì)胞的情況下從樣品中洗掉死懸浮細(xì)胞，所以使用碘化丙啶 (PI) 來染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樣品中的所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來獲得總細(xì)胞數(shù)，并將 PI 陽性（死）細(xì)胞排除在外。同時(shí)實(shí)驗(yàn)嘗試了不同的電轉(zhuǎn)參數(shù)，并將PI染色 結(jié)果、MTS 測(cè)定結(jié)果與總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了比較，如圖2。

根據(jù)圖2統(tǒng)計(jì)結(jié)果，細(xì)胞死亡率隨著電脈沖電壓和持續(xù)時(shí)間的增加而增加。代表細(xì)胞代謝活動(dòng)的 MTS 結(jié)果僅在 1.4 kV/cm 250 µs 至 1.4 kV/cm 500 µs 不包括 1.2 kV/cm 500 µs 的電轉(zhuǎn)后明顯更高。且與 PI 陰性（活細(xì)胞）量相比，僅在1.4 kV/cm 500 µs使用 MTS 測(cè)定法確定的細(xì)胞活力顯著更高。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見PI 染色和代謝活動(dòng)顯示出相似的結(jié)果，相比而言使用 PI 染色可以同時(shí)測(cè)量細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)染效率，所以對(duì)于本實(shí)驗(yàn)PI 方法被優(yōu)于 MTS 方法，在本實(shí)驗(yàn)中以PI染色結(jié)果作為細(xì)胞活性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

 

不同電場(chǎng)強(qiáng)度與脈沖時(shí)間的條件下評(píng)估細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染效率

02

根據(jù)轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活率，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析不同脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的影響趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了不同的電穿孔條件，包括電場(chǎng)強(qiáng)度（1.2、1.4、1.6、1.8 kV/cm）和脈沖持續(xù)時(shí)間（100、250、500、750 μs）的變化。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，施加單個(gè)高壓脈沖，并使用 20 μg/mL 的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖3。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細(xì)胞可分為四個(gè)亞群，轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細(xì)胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細(xì)胞數(shù)，如圖3A。轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞亞群中的pEGFP平均熒光強(qiáng)度如圖3B。

圖3A的數(shù)據(jù)表明，增加脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間是轉(zhuǎn)染/死亡細(xì)胞數(shù)量增加的重要原因，由于一些細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染并且可以產(chǎn)生足夠被檢測(cè)到的EGFP蛋白但已經(jīng)死亡。此外，增加脈沖持續(xù)時(shí)間與轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞比例增加直接相關(guān)。相比之下，脈沖強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞比例的作用不那么明顯。同時(shí)，死細(xì)胞亞群的細(xì)胞數(shù)量也是隨脈沖持續(xù)時(shí)間而非脈沖強(qiáng)度增加。對(duì)于未轉(zhuǎn)染/存活的亞群細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量而言，都是隨著脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的增加而顯著減少。該數(shù)據(jù)表現(xiàn)了了電轉(zhuǎn)參數(shù)選擇的復(fù)雜性。

與此同時(shí)，通過圖3B可知，轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞亞群中平均熒光強(qiáng)度比轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞數(shù)的增加更明顯，結(jié)果表明增加脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間有助于更多質(zhì)粒分子進(jìn)入細(xì)胞。

 

DNase抑制劑對(duì)電穿孔過程的影響

03

使用DNase抑制劑ZnSO4，在之前證明轉(zhuǎn)染效率最高的實(shí)驗(yàn)條件下評(píng)估ZnSO4對(duì)轉(zhuǎn)染效率GET的影響。用 1.4 kV/cm 250 µs、1.6 kV/cm 250 µs、1.8 kV/cm 250 µs、1.2 kV/cm 500 µs、1.4 kV/cm 500 µs 和 1.2 kV/cm 750 對(duì)UT-7 細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，之后分別加入80 µM和100 µM ZnSO4孵育48小時(shí)后分析轉(zhuǎn)染結(jié)果，如圖4。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細(xì)胞可分為四個(gè)亞群，轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細(xì)胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細(xì)胞數(shù)，如圖4A。轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞亞群中的pEGFP平均熒光強(qiáng)度如圖4B。

ZnSO4充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)核酸酶的抑制劑，可以在質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入細(xì)胞后防止質(zhì)粒降解。然而，通過數(shù)據(jù)可知ZnSO4對(duì)UT-7 細(xì)胞的 pEGFP 轉(zhuǎn)染效率沒有作用。如圖 4A所示，同一的電轉(zhuǎn)參數(shù)和不同的ZnSO4濃度，轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞的亞群數(shù)量保持不變。且如圖 4B所示，對(duì)于不同的ZnSO4濃度時(shí)，平均熒光強(qiáng)度沒有顯著變化。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得知，DNase抑制劑ZnSO4并未對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生影響。

 

質(zhì)粒濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

04

為探索在電轉(zhuǎn)溶液中質(zhì)粒pEGFP濃度對(duì) UT-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，測(cè)試了多種質(zhì)粒濃度，包括20µg/mL、50µg/mL、100µg/mL 和 200 µg/mL。使用電壓強(qiáng)度為1.2kV/cm和1.4kV/cm，持續(xù)時(shí)間為 250 µs 的單個(gè)高壓脈沖。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活率，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析不同質(zhì)粒濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性的影響趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染結(jié)果如圖5。每組條件轉(zhuǎn)染后的 UT-7 細(xì)胞可分為四個(gè)亞群，轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞(GFP + /Viable)、轉(zhuǎn)染/死細(xì)胞 (GFP + /Dead)、未轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞 (GFP- /Viable) 和未轉(zhuǎn)染/死為 (GFP- /Dead)，它們的總數(shù)為樣本中的總細(xì)胞數(shù)，如圖5A。轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞亞群中的pEGFP平均熒光強(qiáng)度如圖5B。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知pEGFP 質(zhì)粒濃度是提高 UT-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，將 pEGFP 質(zhì)粒從 20 µM 增加到 200 µM 對(duì)細(xì)胞活力的影響很小，因此較高濃度質(zhì)粒的使用可以獲得更多轉(zhuǎn)染/存活的細(xì)胞。

 

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)電轉(zhuǎn)pEGFP 質(zhì)粒 DNA 到懸浮 UT-7 細(xì)胞系的方案進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UT-7 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染細(xì)胞率和細(xì)胞活力依賴于所選的方波脈沖持續(xù)時(shí)間，并且關(guān)鍵依賴于使用的質(zhì)粒 DNA 濃度，如圖6所示。

實(shí)驗(yàn)分析可知，提高基因電轉(zhuǎn)到UT-7 細(xì)胞中效率的是電脈沖持續(xù)時(shí)間而不是電壓強(qiáng)度。但是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的增加大大降低了細(xì)胞活力，且轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞數(shù)量沒有顯著增加。另一方面，質(zhì)粒濃度的增加大大提高了轉(zhuǎn)染效率，對(duì)細(xì)胞活力影響輕微。

在本次電轉(zhuǎn)優(yōu)化過程中可以得到結(jié)論：1、與脈沖強(qiáng)度相比，高壓脈沖持續(xù)時(shí)間的增加可以更有效的將基因電轉(zhuǎn)到UT-7 細(xì)胞中；2、一味地增加高壓脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致更高的細(xì)胞傷害，而轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞數(shù)量并不會(huì)增加；3、與脈沖持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度相比，pDNA 濃度的增加對(duì)轉(zhuǎn)染/活細(xì)胞亞群增加的影響更為顯著；4、DNAase 抑制劑 ZnSO4 對(duì) pDNA 電轉(zhuǎn)到UT-7 細(xì)胞沒有影響，也不影響細(xì)胞活力。

討論

1.對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行不同電轉(zhuǎn)參數(shù)下電轉(zhuǎn)結(jié)果的測(cè)定方法與統(tǒng)計(jì)方法，有利于對(duì)電轉(zhuǎn)細(xì)胞條件的討論，推薦使用pDNA熒光與PI結(jié)果分析細(xì)胞活率和轉(zhuǎn)染效率。可多組進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)電轉(zhuǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞不推薦使用程序型的電轉(zhuǎn)染或核轉(zhuǎn)染設(shè)備，由于其具體電脈沖參數(shù)用戶無法得知且不允許用戶控制電轉(zhuǎn)染參數(shù)，客戶無法根據(jù)需要對(duì)電穿孔過程的具體參數(shù)進(jìn)行調(diào)整達(dá)到最優(yōu)電轉(zhuǎn)效果。

2.對(duì)于難轉(zhuǎn)細(xì)胞優(yōu)化電轉(zhuǎn)效率的方向，首先考慮提高質(zhì)粒的濃度，其次考慮適當(dāng)增加高壓脈沖的持續(xù)時(shí)間和電壓強(qiáng)度，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)際情況調(diào)整電轉(zhuǎn)條件。

 

 

產(chǎn)品介紹
日本BEX公司新款CUY21EDITIl電轉(zhuǎn)化儀，采用先進(jìn)的脈沖技術(shù)，是一款無需專用試劑的全功能多模式活體細(xì)胞轉(zhuǎn)染儀器，目前已廣泛應(yīng)用于全球?qū)嶒?yàn)室。CUY21可應(yīng)用于細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，尤其適合于原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高轉(zhuǎn)化率和高存活率轉(zhuǎn)化。同時(shí)CUY21還可應(yīng)用于貼壁細(xì)胞、離體受精卵及活體的基因轉(zhuǎn)染，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)電極進(jìn)行體內(nèi)體外的轉(zhuǎn)染。

 

參考文獻(xiàn)

[1] Vadeikienė R, Jakštys B, Ugenskienė R, Šatkauskas S, Juozaitytė E. Systemic Optimization of Gene Electrotransfer Protocol Using Hard-to-Transfect UT-7 Cell Line as a Model. Biomedicines. 2022 Oct 24;10(11):2687. doi: 10.3390/biomedicines10112687. PMID: 36359207; PMCID: PMC9687892.

[2] Jordan ET, Collins M, Terefe J, Ugozzoli L, Rubio T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 2008 Dec;19(5):328-34. PMID: 19183796; PMCID: PMC2628074.

[3] Delgado-Cañedo A, Santos DG, Chies JA, Kvitko K, Nardi NB. Optimization of an electroporation protocol using the K562 cell line as a model: role of cell cycle phase and cytoplasmic DNAses. Cytotechnology. 2006 Jul;51(3):141-8. doi: 10.1007/s10616-006-9028-1. Epub 2006 Nov 14. PMID: 19002884; PMCID: PMC3449805.