到His標(biāo)簽，大家一定都不陌生。His標(biāo)簽是一個只有6個組氨酸的小標(biāo)簽，但神通廣大。首先，His標(biāo)簽比較小，對蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響較小，一般純化后也可以無需切除；其次，His標(biāo)簽可以和其他標(biāo)簽一起使用，增加純化的純度；此外，His標(biāo)簽也可以在變性條件下進(jìn)行蛋白純化，適用于特殊的操作或者包涵體純化；最后，His標(biāo)簽蛋白的純化方式多樣，純化工藝也非常成熟，可以選擇重力操作和離心操作，也可以選擇AKTA純化系統(tǒng)。
 

His標(biāo)簽如此好用，各位是不是也躍躍欲試了呢？今天小優(yōu)給大家整理了我們使用頻率很高的重力純化以及儀器純化的操作流程，一起來看看吧！

 

重力純化：以cytiva品牌Ni Sepharose 6FF 填料（17531806）為例

 

1.緩沖液配制

按照以下配方進(jìn)行緩沖液配置：

①結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，PH7.4

緩沖液配置完成后需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。

 

2.樣品準(zhǔn)備

樣品應(yīng)完全溶解。為了避免色譜柱堵塞，建議離心并通過0.45 μm過濾器過濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。如果樣品溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的緩沖液中，將其NaCl濃度調(diào)整為0.5 M, pH為7-8

 

3.純化前準(zhǔn)備

①PD-10重力空柱（17043501）準(zhǔn)備。用20%的乙醇洗滌濾膜，用蒸餾水潤洗濾膜，然后將濾膜放入PD-10空柱；

②填料準(zhǔn)備。將需要量的填料懸濁液從瓶中轉(zhuǎn)移到離心管中，用500xg離心5min以沉淀填料。除去上清，加入適量蒸餾水，輕柔的振蕩填料懸濁液3min，用500xg離心 5min。除去上清，加入適量結(jié)合緩沖液進(jìn)行平衡，輕柔的振蕩填料懸濁液3min，用500xg離心 5min。然后把填料懸濁液轉(zhuǎn)移到量筒中，再加入適量體積的結(jié)合緩沖液，使懸濁液中的填料濃度達(dá)到50%。

 

4.重力柱純化

①將樣品加入含有50%填料的懸濁液中（樣品在上柱前要進(jìn)行離心和過濾）。Ni Sepharose 6FF的平均載量是40mg/ml。則1ml的50%懸濁液的載量為大約20mg蛋白。

②將樣品和填料混合物在搖床上低速混合1h。

③將樣品和填料混合物加入到PD-10的空柱中，收集流出物。

④用結(jié)合緩沖液洗滌2-5個柱體積，收集流出物。

⑤用4個柱體積的洗脫緩沖液洗脫，收集流出物。

 

5.檢測

對流出物進(jìn)行檢測分析，跑膠鑒定

 

儀器純化：以cytiva品牌HisTrap FF 預(yù)裝柱（17531901）為例

 

1.緩沖液配制

按照以下配方進(jìn)行緩沖液配置，

①結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉緩沖液，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，PH7.4

緩沖液配置完成后需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。

 

2.樣品準(zhǔn)備

樣品應(yīng)完全溶解。為了避免色譜柱堵塞，建議離心并通過0.45 μm過濾器過濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。如果樣品溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的緩沖液中，將其NaCl濃度調(diào)整為0.5 M, pH為7-8

 

3.系統(tǒng)準(zhǔn)備與裝柱

①系統(tǒng)設(shè)置一個低流速，移除預(yù)裝柱頂部的堵頭，把柱子連接到ӒKTA純化儀的接頭上，注意要液滴對液滴進(jìn)行連接，防止引入氣泡。

②去除柱子底部的堵頭，連接到純化儀上。

③用3-5個柱體積的蒸餾水洗去乙醇。

④用5個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，建議流速是1ml/min（1ml 體積柱子）。

 

4.上樣

用上樣環(huán)或者 superloop 加入預(yù)處理的樣品（樣品在上柱前一定要進(jìn)行離心和過濾），在上樣時建議流速為 0.2-1ml/min（1ml 體積柱子）。

 

5.洗雜

用結(jié)合緩沖液洗滌至少10-15個柱體積，直到吸收峰達(dá)到穩(wěn)定基線或在流出物中沒有物質(zhì)流出。洗滌過程中建議保持流速為1-2ml/min（1ml 體積柱子）。

 

6.洗脫

用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（拉咪唑濃度梯度）。一步洗脫通常5個柱體積，線性洗脫通常10-20個柱體積。在洗脫過程中保持流速為1-2ml/min（1ml體積柱子）。

 

7.清洗與保存

洗脫后，用3-5個柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。
 

重力法的操作簡便，易于控制層析柱液體的流動，而且也容易確定目的樣品收集的起點(diǎn)與終點(diǎn)；但由于液體的流動是重力驅(qū)動的，過柱速度較慢，一次純化實(shí)驗(yàn)可能耗費(fèi)較長的時間。而使用純化儀器+預(yù)裝柱的方法，則可以更加輕松準(zhǔn)確的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HiTrap型預(yù)裝柱除了可以連接在層析系統(tǒng)中使用，也可以連接注射器手動操作，或者連接在恒流泵（蠕動泵）上運(yùn)行。
 

總的來說，His標(biāo)簽蛋白純化主要包括前期樣品、相關(guān)試劑和耗材的準(zhǔn)備，在純化這一塊，都是標(biāo)準(zhǔn)的平衡-上樣-清洗-洗脫-再生-保存的流程。
 

 

在蛋白純化領(lǐng)域，我們也可以給大家提供很多的精品資源。例如標(biāo)簽蛋白純化解決方案為大家詳細(xì)介紹原核細(xì)胞標(biāo)簽蛋白純化從質(zhì)粒構(gòu)建到蛋白表達(dá)到蛋白純化每個過程的詳細(xì)步驟以及操作技巧，有需要的同學(xué)戳鏈接自取哦！
 

cytiva預(yù)裝柱和填料方面可供選擇的產(chǎn)品較多，除了今天的高流速FF系列，還有高流速HP和高耐受Excel系列等等，不同材料之間的特點(diǎn)如下圖所示，幫助您快速選擇所需產(chǎn)品。