類器官正在迅速成為基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)的有力工具，這些與自身器官結(jié)構(gòu)類似的三維（3D）組織可在體外生長，形成其原生器官的“微縮版本”。作為自我組織和自我更新的三維結(jié)構(gòu)，類器官比傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，并提供了一個更符合生理學(xué)的環(huán)境，可更清晰地了解復(fù)雜的生物學(xué)。

類器官培養(yǎng)的起始點可以是存在于組織中的特異性成人干細胞、從患者活檢樣本中提取的腫瘤干細胞、胚胎干細胞（ESCs）或多能干細胞（iPSCs）。在三維細胞外基質(zhì)中進行培養(yǎng)，這些培養(yǎng)物能夠高度保真地重現(xiàn)出已分化組織的體內(nèi)架構(gòu)、空間形態(tài)以及原始組織中細胞群的遺傳多樣性[1]。

由Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)和配套類器官分析軟件實現(xiàn)的定量化、免標記的體外分析方法，逐漸成為類器官在基礎(chǔ)研究、疾病建模和藥物篩選中的必要條件。

A  類器官培養(yǎng)條件優(yōu)化
 

Incucyte® 類器官實驗流程

Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)可完成數(shù)小時、數(shù)天或數(shù)周的細胞健康狀態(tài)監(jiān)測，可從4個參數(shù)進行類器官培養(yǎng)狀態(tài)分析：

1  類器官大小和數(shù)量


確定最大類器官擴增的最優(yōu)條件。將小鼠肝臟類器官嵌入Matrigel® Dome（100%），在48 孔板中以多種密度接種。接種后五天獲取BF 圖像。每隔6 小時收集數(shù)據(jù)，總計168 小時。4 倍鏡拍攝所有圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值±SEM，n=14 個孔。

2  偏心度和暗度


使用綜合形態(tài)定義特定細胞類型的傳代頻率。將小鼠肝臟類器官嵌入24 孔板中的100% Matrigel® Dome（1:10 傳代）。每隔6 小時收集數(shù)據(jù)，總計192 小時。4 倍鏡拍攝所有圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值± SEM，n=6 個孔。

該功能可用于優(yōu)化類器官培養(yǎng)條件，鑒定類器官最佳成熟階段，實時監(jiān)測類器官分化及生長效率，提供高通量、實時、自動的類器官分析方案。

B  類器官藥敏分析
 
日本福島縣立醫(yī)科大學(xué)的研究人員[2]使用Incucyte® 與Caspase-3/7 綠色熒光染料相結(jié)合觀察經(jīng)典抗腫瘤藥物紫杉醇、卡鉑、絲裂霉素C對患者來源腫瘤類器官（F-PDOs）的細胞生長抑制作用。


10 μM藥物孵育6天中的F-PDOs使用Caspase-3/7 綠色熒光染料監(jiān)測結(jié)果顯示絲裂霉素C樣本組中有明顯的凋亡蛋白酶激活現(xiàn)象；而在紫杉醇樣本組中雖然能看到抑制F-PDOs球體生長的效果，但凋亡蛋白酶激活信號不顯著。

有趣的是，紫杉醇的細胞生長抑制作用在長時間觀察后發(fā)現(xiàn)并不完全依賴于Caspase凋亡通路。此外，這些結(jié)果也與患者臨床上的耐藥性一致，顯示類器官培養(yǎng)體系可作為進一步的臨床用藥指導(dǎo)。

值得注意的是，在3D活細胞成像方面我們需注意過度曝光可能導(dǎo)致細胞損傷，從而導(dǎo)致生物學(xué)行為的改變，對實驗分析和解釋產(chǎn)生負面影響。光毒性效應(yīng)是累積的，與激發(fā)光強度和總光子負荷成正比。因此，非侵入性實時3D成像的成功應(yīng)用，關(guān)鍵在于平衡，以最大限度地提高光收集效率，同時最小化總樣本量的激發(fā)能量。因此，Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)，采用專利的圖像采集技術(shù)，結(jié)合Incucyte® 類器官分析軟件可實現(xiàn)對類器官形成和生長過程動態(tài)、定性、準確的評價。

這一突破性的成像與分析技術(shù)對于類器官技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展具有重要的優(yōu)勢：

• 自動定位分析嵌入 Matrigel® Dome 中的 3D 類器官
• 使用集成、實時免標記的數(shù)據(jù)
• 采集優(yōu)化和定義培養(yǎng)條件和方案根據(jù)綜合的形態(tài)參數(shù)，確定用于類器官培養(yǎng)物的傳代或擴增的最佳時間
• 評估多次傳代期間的培養(yǎng)質(zhì)量

 
毫無疑問，人類類器官系統(tǒng)將繼續(xù)進步，以更好地理解復(fù)雜的疾病機制。客觀準確地定義諸如接種密度、傳代頻率和形態(tài)等參數(shù)，對于建立用于下游研究的健康培養(yǎng)物和釋放類器官的全部潛力至關(guān)重要。Incucyte® 幫助科學(xué)家從類器官大小、數(shù)量、偏心率（圓度）和暗度（亮度）四個參數(shù)，無偏倚地評估類器官生長狀態(tài)，從而消除人的主觀性解讀。

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《3D細胞模型 | 類器官分析指南》

-參考文獻-

• Dutta D, Heo I, Clevers H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends Mol Med. 2017 May;23(5):393-410. doi: 10.1016/j.molmed.2017.02.007.
• Tamura H, Higa A, Hoshi H, Hiyama G, Takahashi N, Ryufuku M, Morisawa G, Yanagisawa Y, Ito E, Imai JI, Dobashi Y, Katahira K, Soeda S, Watanabe T, Fujimori K, Watanabe S, Takagi M. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep. 2018 Aug;40(2):635-646. doi: 10.3892/or.2018.6501.