了解細(xì)胞周期
 

細(xì)胞周期(cell cycle)是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程。通常將子細(xì)胞形成作為一次細(xì)胞分裂結(jié)束的標(biāo)志，細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開(kāi)始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過(guò)程。在這一過(guò)程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。

1.細(xì)胞周期的主要階段

細(xì)胞周期通常被分為四個(gè)主要階段。前三個(gè)階段通常被稱為間期，它們?yōu)榈谒膫�(gè)階段—有絲分裂做準(zhǔn)備。
 

 

1.1 G1期—細(xì)胞生長(zhǎng)

細(xì)胞體積不斷增加并增加mRNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的產(chǎn)量，為后續(xù)階段做準(zhǔn)備。

1.2 S期—DNA合成

mRNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)量降低，細(xì)胞專注于復(fù)制其所有的DNA，為每條染色體創(chuàng)造一個(gè)副本。這兩個(gè)相同的拷貝，稱為姐妹染色體，在一個(gè)稱為中心點(diǎn)的地方相互連接在一起。
 

DNA已被復(fù)制，所以染色體由兩個(gè)相同的姐妹染色體組成，在中心點(diǎn)連接在一起。
 

1.3 G2期—為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備

細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)并合成最后階段所需的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。

1.4 M期—通過(guò)有絲分裂形成子細(xì)胞

核膜破裂，釋放出染色體。姐妹染色單體分離，形成兩個(gè)相同的細(xì)胞核，被拉到細(xì)胞的兩側(cè)。然后，它將細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)分成兩個(gè)相等的部分，將DNA和細(xì)胞器分在它們之間。兩個(gè)遺傳上完全相同的子細(xì)胞就這樣產(chǎn)生了。
 

1.5 離開(kāi)細(xì)胞周期—G0期

細(xì)胞完成M期后，兩個(gè)子細(xì)胞再次進(jìn)入G1期。從這里開(kāi)始，它們可以繼續(xù)細(xì)胞周期并再次進(jìn)行分裂，或者離開(kāi)細(xì)胞周期并停止分裂。退出細(xì)胞周期的細(xì)胞進(jìn)入G0期，它仍然具有完全的功能，但不再進(jìn)行分裂。一些細(xì)胞永遠(yuǎn)不會(huì)再離開(kāi)G0期，如大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞，而其他細(xì)胞可以重新進(jìn)入G1期，并在必要時(shí)繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期。像大多數(shù)上皮細(xì)胞一樣，一些細(xì)胞從未進(jìn)入G0期，但在其一生中繼續(xù)分裂。

2.細(xì)胞周期檢查點(diǎn)

為了確保細(xì)胞周期的每個(gè)階段都能正確進(jìn)行，每個(gè)階段后有一個(gè)檢查點(diǎn)。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是一種控制機(jī)制，在細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)步驟之前必須滿足某些條件。檢查點(diǎn)失敗會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，阻止細(xì)胞在解決問(wèn)題之前繼續(xù)進(jìn)行。

目前，研究細(xì)胞周期的最常見(jiàn)方法是使用流式細(xì)胞術(shù)。然而，流式細(xì)胞術(shù)存在一些缺點(diǎn)：(1) 需要準(zhǔn)備大量的細(xì)胞樣品，最終可能會(huì)造成細(xì)胞樣品的浪費(fèi)；(2) 樣品必須為單細(xì)胞懸液；(3) 不能確定組織結(jié)構(gòu)，一些罕見(jiàn)的大細(xì)胞難以分析；（4）無(wú)法檢測(cè)分泌蛋白等。
  因此，在細(xì)胞周期研究中，使用HoloMonitor®活細(xì)胞成像系統(tǒng)有幾個(gè)好處：它是完全非侵入性的，不使用細(xì)胞毒性的染色劑；它不需要任何樣品預(yù)處理；所研究的細(xì)胞不會(huì)被浪費(fèi)，而是可以繼續(xù)使用；它可以直接在常規(guī)培養(yǎng)箱內(nèi)操作。
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分享具體案例
 

以下是使用HoloMonitor M4研究細(xì)胞周期的具體案例：

 

Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time
 

半胱氨酸組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X（或Z）的天然抑制劑家族稱為胱抑素。人類(lèi)胱抑素中含量最高的是胱抑素C。它是一種2型胱抑制素，存在于體液、組織和細(xì)胞中。胱抑素C對(duì)幾乎所有的半胱氨酸蛋白酶都有抑制作用。有研究表明，胱抑素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，保護(hù)細(xì)胞免受誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的氧化應(yīng)激并可以影響細(xì)胞因子釋放。人體細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)蛋白水解受到天然分泌的胱抑素的影響，因此它可能被用于抑制腫瘤生長(zhǎng)。

在這篇文章中，H.Wallin和同事采用HoloMonitor M4活細(xì)胞成像儀對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期長(zhǎng)度和細(xì)胞形態(tài)（面積和光學(xué)厚度）進(jìn)行研究，旨在探討外部添加的胱抑素C是否能夠影響黑色素癌細(xì)胞的增殖，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

2.1 胱抑素C對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響

為了研究A375細(xì)胞群的生長(zhǎng)，我們使用HoloMonitor M4活細(xì)胞成像儀實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞。在48小時(shí)內(nèi)每小時(shí)拍攝一次全息圖像，在每個(gè)圖像中定義和計(jì)數(shù)細(xì)胞以繪制生長(zhǎng)曲線（圖1）。與對(duì)照組細(xì)胞（146 000 ± 58 000）相比，5 µM胱抑素C的存在使細(xì)胞數(shù)減少到55%（81 000 ± 37 000）。以上結(jié)果表明，胱抑素C會(huì)降低A375細(xì)胞增殖率。

圖1 A375細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 胱抑素C對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)（面積和光學(xué)厚度）的影響

為了探究胱抑素C是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，我們使用HoloMonitor M4研究了A375細(xì)胞與胱抑素C共培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。在12和24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，使用胱抑素C的培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，但細(xì)胞看起來(lái)健康，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中繼續(xù)增殖（圖2A）。相比之下，在100 µM H2O2（已知可誘導(dǎo)A375細(xì)胞死亡）存在下培養(yǎng)的A375細(xì)胞面積較小且不增殖（圖2A）�；�本上，用H2O2處理的細(xì)胞在12小時(shí)后顯示出小面積和高厚度（圖2B）。另一方面，添加胱抑素C培養(yǎng)的A375細(xì)胞在面積和厚度方面與對(duì)照細(xì)胞相似。

以上表明胱抑素C不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖2 用H2O2或胱抑素C處理的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。(A) 將A375細(xì)胞與H2O2或胱抑素C孵化，并在0、12和24小時(shí)后采集數(shù)字全息顯微鏡圖像，細(xì)胞厚度以顏色編碼顯示，如右側(cè)色條所示。(B)細(xì)胞的面積（µm）與平均光學(xué)細(xì)胞厚度（µm）的散點(diǎn)圖。
 

2.3 胱抑素C對(duì)A375細(xì)胞周期長(zhǎng)度的影響

為了進(jìn)一步研究外源胱抑素C對(duì)A375細(xì)胞分裂影響，使用HoloMonitor M4追蹤A375細(xì)胞。

對(duì)得到的每個(gè)細(xì)胞分裂的子細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并在后期圖像中繼續(xù)追蹤（圖3）。并由此構(gòu)建生成樹(shù)和計(jì)算單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞分裂時(shí)間。

圖3. 使用HoloMonitor M4追蹤A375細(xì)胞分裂的數(shù)字全息圖像。（A，B）相隔5分鐘拍攝的相同位置的圖像。

圖4顯示了在培養(yǎng)基中沒(méi)有胱抑素C（左）或有胱抑素C（右）的情況下生長(zhǎng)的A375細(xì)胞的生成樹(shù)的例子。當(dāng)A375細(xì)胞在胱抑素C存在下培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞周期更長(zhǎng)，細(xì)胞分裂次數(shù)更少。

圖4. 存在或不存在胱抑素C的情況下生長(zhǎng)的A375細(xì)胞的生成樹(shù)
 

具體來(lái)看，A375細(xì)胞周期的時(shí)間存在明顯差異。一些細(xì)胞分裂的時(shí)間是細(xì)胞周期中位數(shù)的兩倍以上，特別是在細(xì)胞周期1和細(xì)胞在胱抑素C存在下生長(zhǎng)的情況下（圖5A）。

在分析所有細(xì)胞時(shí)，48小時(shí)中完成的細(xì)胞周期數(shù)也有很大的變化。少數(shù)細(xì)胞（<5%）沒(méi)有移動(dòng)或分裂。其他細(xì)胞周期短，分裂次數(shù)多。最常見(jiàn)的是3次完成的細(xì)胞分裂，無(wú)論是否添加胱抑素C（圖5B）。然而，在胱抑素C的存在下，只有11%的被追蹤的細(xì)胞成功地分裂了4次，而26%的對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)了4次分裂，甚至有些細(xì)胞出現(xiàn)了5次分裂（圖5B）。
 

以上結(jié)果表明，外部添加的胱抑素C減少了A375細(xì)胞分裂的次數(shù)并增加了細(xì)胞周期時(shí)間，特別是第一個(gè)細(xì)胞周期。
 

圖5. 外部添加的胱抑素C增加了細(xì)胞周期時(shí)間，減少了A375細(xì)胞分裂的次數(shù)。
 

HoloMonitor M4采用高分辨率成像技術(shù)，它能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)和定量單個(gè)和整個(gè)細(xì)胞群并且無(wú)需事先提取細(xì)胞、染色或?qū)⒓?xì)胞暴露于有害光源。該技術(shù)有可能發(fā)展成為一種快速且經(jīng)濟(jì)高效的癌癥治療效果臨床前監(jiān)測(cè)方法。在這篇文章中，使用HoloMonitor M4觀測(cè)可知，胱抑素C通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期時(shí)間影響黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，胱抑素C具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖的能力，并可能用于抑制腫瘤生長(zhǎng)。

 

 

在細(xì)胞周期研究中，HoloMonitor M4除了上述案例中提及的能監(jiān)控細(xì)胞分裂次數(shù)和確定細(xì)胞周期長(zhǎng)度以外，還能用于研究細(xì)胞周期阻滯、測(cè)量有絲分裂持續(xù)時(shí)間、捕捉異常細(xì)胞分裂以及研究細(xì)胞周期進(jìn)展等。HoloMonitor M4可以精準(zhǔn)定位單個(gè)細(xì)胞，提供完整的單細(xì)胞遷移軌跡，速率以及其他多達(dá)30種細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)。除此之外，用戶可以從同一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品中獲取其他相關(guān)信息，例如細(xì)胞形態(tài)參數(shù)，繁殖速率等，使其真正成為一款智能化、全性能、全自動(dòng)的活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，為您帶來(lái)全新的活細(xì)胞成像體驗(yàn)。
 

參考文獻(xiàn)：

[1] Wallin H, Hunaiti S, Abrahamson M. Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time. FEBS Open Bio. 2021 Jun;11(6):1645-1658. doi: 10.1002/2211-5463.13162.